Чувствительны только in vitro что значит
Когда «работает» не все: определение чувствительности к антибиотикам
Всемирная организация здравоохранения заявляет: «Устойчивость бактерий к антибиотикам возрастает до угрожающе высоких уровней во всем мире». В таких условиях даже «банальный» отит или тонзиллит может приобретать затяжное, осложненное течение, не говоря о риске в отношении потенциально летальных инфекций. Как выяснить какой препарат эффективен против «своей» патогенной флоры? И какой анализ выбрать?
«Классический» способ
Некоторые представители бактериальной флоры обладают поразительной способностью к мутациям. Бактерии, еще вчера чувствительные к простому пенициллину, сегодня – «не реагируют» на куда более «продвинутые» антибиотики.
Поэтому в современной медицине лечение бактериальных процессов без понимания особенностей возбудителя представляется «занятием» сомнительным и бесперспективным. В лучшем случае, воспаление просто «затихнет» на короткое время, а в худшем – разовьется до угрожающих жизни масштабов.
Особенно опасна такая ситуация в отношении хирургических больных, новорожденных и людей с ослабленным иммунитетом, а также тех, для кого прием антибиотиков стал нормой жизни.
Микробиологические способы идентификации возбудителей уже давно используются медициной всего мира, а современные анализаторы сделали этот процесс быстрее и эффективнее.
Так, посев на флору с определением чувствительности к антибиотикам позволяет не только «узнать» бактерии, но и проверить их чувствительность к стандартному (6-8) или расширенному (до 12) спектру антибиотиков.
В результате будет указан не только вид бактерий, но и их количество и реакция на препарат:
Правда у анализа есть и недостатки:
Новое поколение
Потребность медицины в быстром и качественном микробиологическом исследовании «подтолкнула» науку к созданию метода MALDI-TOF MC, удостоенного Нобелевской премии в 2002 году.
Метод основан на идентификации уникального белкового состава бактерий, представляющего собой своего рода «отпечаток пальца». Его точность достигает 98%. А в анализатор заложена информация более чем о 750 видах клинически значимых микроорганизмах, с возможностью «обновления базы данных».
Кроме того, примененеие идентификации MALDI-TOF MC в составе комплексных исследований позволяет проверить чувствительность микрофлоры к 18-20 препаратам, против максимально-возможных 12 у предыдущих «поколениях» посевов. В результате анализа теперь можно увидеть не только эффективность антибиотика, но и подобрать по протоколу минимальную действующую дозу препарата.
Метод полностью автоматизирован, что исключает влияние человеческого фактора на результат. А готовность исследования составляет максимум 4 дня.
Активность антибактериальных средств in vitro
Грамотрицательные неферментирующие микроорганизмы широко распространены в окружающей среде. Одной из серьезных проблем является диагностика вызванных ими инфекций, связанная с объективными трудностями их выделения и идентификации. Второй проблемой является то, что для них характерна полирезистентность к антимикробным препаратам, включая те, которые обычно активны против Pseudomonas aeruginosa.
В данном исследовании определялась антибактериальная активность in vitro различных препаратов по отношению к 177 выделенным в клинике штаммам неферментирующих бактерий (кроме Pseudomonas aeruginosa и Acinetobacter spp.). МПК определялась методом разведений в агаре. Использовали среду Мюллера-Хинтона. Оценивали активность ампициллина, пиперациллина, пиперациллин/тазобактама, сульбактама, цефоперазона, цефоперазон/сульбактама, цефтазидима, цефепима, азтреонама, имипенема, меропенема, колистина, гентамицина, амикацина, триметоприм/сульфаметоксазола, хлорамфеникола, эритромицина, рифампицина, норфлоксацина, ципрофлоксацина и миноциклина.
У 7 изолятов: Sphingobacterium multivorum(2), Sphingobacterium spiritivorum(1), Empedobacter brevis(1), Weeksella virosa(1), Bergeyella zoohelcum(1) и Oligella urethralis (1), вместо чувствительности к цефоперазону или сульбактаму определяли чувствительность к амоксициллин/клавуланату и ампициллин/сульбактаму.
Полирезистентность к антибактериальным препаратам была характерна для таких возбудителей, как Stenotrophomonas maltophilia, Burkholderia cepacia, Chryseobacterium spp., Myroides spp., Achromobacter xylosoxidans и Ochrobactrum anthropi.
В то же время, такие микроорганизмы, как Pseudomonas stutzeri, Shewanella putrefaciens-algae, Sphingomonas paucimobilis, Pseudomonas oryzihabitans, Bergeyella zoohelcum, Weeksella virosa и Oligella urethralis часто были чувствительны к большинству из тестируемых антибиотиков.
Учитывая, что различные виды возбудителей, образующих группу грамотрицательных неферментирующих микроорганизмов, демонстрируют различные показатели антибиотикорезистентности, для выбора оптимальной схемы лечения требуется проведение микробиологического исследования с идентификацией возбудителя и выявления показателей его антибиотикорезистентности. Феномен полирезистентности, характерный для ряда возбудителей, требует активной разработки новых антибактериальных средств или поиска новых комбинаций антибиотиков, обладающих синергизмом бактерицидного действия по отношению к данным микроорганизмам.
«In vitro» activity of different antimicrobial agents on Gram-negative nonfermentative bacilli, excluding Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter spp. (Vay C.A., Almuzara M.N., Rodriguez C.H., Pugliese M.L., Lorenzo Barba F., Mattera J.C., Famiglietti A.M. Rev. Argent Microbiol., 2005;37(1):34-45).
Код вставки на сайт
Активность антибактериальных средств in vitro
Грамотрицательные неферментирующие микроорганизмы широко распространены в окружающей среде. Одной из серьезных проблем является диагностика вызванных ими инфекций, связанная с объективными трудностями их выделения и идентификации. Второй проблемой является то, что для них характерна полирезистентность к антимикробным препаратам, включая те, которые обычно активны против Pseudomonas aeruginosa.
В данном исследовании определялась антибактериальная активность in vitro различных препаратов по отношению к 177 выделенным в клинике штаммам неферментирующих бактерий (кроме Pseudomonas aeruginosa и Acinetobacter spp.). МПК определялась методом разведений в агаре. Использовали среду Мюллера-Хинтона. Оценивали активность ампициллина, пиперациллина, пиперациллин/тазобактама, сульбактама, цефоперазона, цефоперазон/сульбактама, цефтазидима, цефепима, азтреонама, имипенема, меропенема, колистина, гентамицина, амикацина, триметоприм/сульфаметоксазола, хлорамфеникола, эритромицина, рифампицина, норфлоксацина, ципрофлоксацина и миноциклина.
У 7 изолятов: Sphingobacterium multivorum(2), Sphingobacterium spiritivorum(1), Empedobacter brevis(1), Weeksella virosa(1), Bergeyella zoohelcum(1) и Oligella urethralis (1), вместо чувствительности к цефоперазону или сульбактаму определяли чувствительность к амоксициллин/клавуланату и ампициллин/сульбактаму.
Полирезистентность к антибактериальным препаратам была характерна для таких возбудителей, как Stenotrophomonas maltophilia, Burkholderia cepacia, Chryseobacterium spp., Myroides spp., Achromobacter xylosoxidans и Ochrobactrum anthropi.
В то же время, такие микроорганизмы, как Pseudomonas stutzeri, Shewanella putrefaciens-algae, Sphingomonas paucimobilis, Pseudomonas oryzihabitans, Bergeyella zoohelcum, Weeksella virosa и Oligella urethralis часто были чувствительны к большинству из тестируемых антибиотиков.
Учитывая, что различные виды возбудителей, образующих группу грамотрицательных неферментирующих микроорганизмов, демонстрируют различные показатели антибиотикорезистентности, для выбора оптимальной схемы лечения требуется проведение микробиологического исследования с идентификацией возбудителя и выявления показателей его антибиотикорезистентности. Феномен полирезистентности, характерный для ряда возбудителей, требует активной разработки новых антибактериальных средств или поиска новых комбинаций антибиотиков, обладающих синергизмом бактерицидного действия по отношению к данным микроорганизмам.
Диагностика или тестирование in vitro. Что это такое?
In vitro — латинское выражение, означающее, буквально, «в стекле». In vitro медицинские тесты — это тесты, проводимые в контролируемом окружении вне живого организма.
Определения:
Термин in vitro означает, что медицинские процедуры, тесты и эксперименты проводятся вне живого организма. Исследование in vitro проводится в контролируемой среде, к примеру такой, как пробирка или чашка Петри.
Термин in vivo, означает, что исследование проводится в естественных условиях. Это относится к тестам, экспериментам и процедурам, которые ученые выполняют на живом организме, таком как человек, лабораторное животное или растение.
Тестирование in vitro — это по сути простая методология исследования. Ученые могут проводить детальные анализы и изучать биологические эффекты у гораздо большего числа объектов in vitro, чем в экспериментах на животных или людях. Однако, хотя чашки Петри и пробирки обеспечивают контролируемую среду для испытаний in vitro, они не могут воспроизвести все те условия, которые происходят внутри живого организма. Таким образов, интерпретировать данные in vitro необходимо с осторожностью, так как полученные результаты не могут со 100% гарантией точно предсказать результаты исследований в реалии живого существа.
Один из примеров исследований in vitro — фармацевтические испытания новых лекарственных препаратов, которые проходят тестирование in vitro, прежде, чем начинаются клинические испытания.
В применении к методикам и рекомендациям проведения тестирования на выявление антител и антигенов коронавирусной инфекции, in vitro диагностика включает следующие рекомендации:
ООО «Группа АРТОС»
ИНН 7728694854, ОГРН 1097746127401
г. Москва, ул. Бутлерова 17 Б
In vivo — in vitro — in silico
In vivo — in vitro — in silico
Кремний (Si), химический элемент IV группы периодической системы Менделеева; атомный номер 14, атомная масса 28,086. Кремний — полупроводник, нашедший широкое применение в электронике для изготовления элементов полупроводниковых схем (от простейших транзисторов до сверхбыстрых современных процессоров).
Автор
Редакторы
Статья является введением к теме «Сухая биология» — в ней раскрывается смысл понятия in silico, а так же обсуждается его взаимосвязь с такими устоявшимися терминами как in vivo и in vitro.
Открывая этот новый раздел, хочется сказать несколько вводных слов, так как у большинства читателей наверняка может возникнуть вопрос: «что такое „in silico“?».
За последние несколько десятилетий развитие компьютерной техники достигло небывалых размахов. И как следствие компьютеризация захватила многие отрасли науки и техники. Биология также не является исключением. Если раньше компьютер рассматривался лишь как средство обработки экспериментальных данных, характер которых мог быть чрезвычайно разнообразным, от статистических исследований численности популяций, до обработки данных рентгеноструктурного анализа, то со временем стала развиваться идея полностью компьютерного эксперимента. Теперь компьютер стал рассматриваться как среда проведения эксперимента, т.е. имея на входе определенные исходные параметры, мы можем получить некие результаты моделирования, описывающие поведение исследуемой нами системы. Для обозначения всего, что связано с компьютерными экспериментами, в 90-е годы XX века даже возник полушутливый латинизм — in silico (от in silicon, т.е. «в кремнии» — подробнее см. 1–2), который дополнил ряд уже имеющихся еще с конца позапрошлого столетия классических определения характера экспериментальной среды — in vivo («вживую» — т.е. непосредственно в биологической системе), in vitro («в стекле», то есть в среде искусственно созданной — в пробирке), см. рис. 1. Термины in vivo и in vitro хорошо прижились среди экспериментаторов, однако смысл их использования достаточно относителен. Так, под in vivo молекулярный биолог, изучающий аспекты синтеза белка, может подразумевать колонию искусственно выращенных клеток, а под in vitro — систему бесклеточного синтеза в пробирке. При этом, для физиолога, изучающего механизмы проведения нервного импульса, in vivo — это целый организм, а in vitro — культура нервной ткани. В свою очередь, подход in silico также многоуровневый и включает в себя задачи по моделированию поведения отдельных молекул, биохимических процессов и даже функционированию отдельных физиологических систем.
Рисунок 1. Многоуровневый подход в изучении биологических систем: in vivo — т.е. в живом объекте (а), in vitro — т.е. в искусственно смоделированной среде (б), in silico — т.е. в полностью смоделированной на компьютере биологической системе (в).
Учитывая тематику нашего сайта, в разделе «Сухая биология» мы будем помещать материалы, в основном посвященные современным методам молекулярного моделирования. Молекулярное моделирование — это один из аспектов понятия in silico, который представляет из себя набор вычислительных методов, позволяющих с разной степенью физичности на атомарном уровне изучать молекулярные системы разной сложности. Методы молекулярного моделирования можно разбить на определенные группы, которые объединяют различные подходы, позволяющие решать задачи разного характера. К первой такой группе можно отнести все методики анализа биологических текстов (аминокислотных и нуклеотидных последовательностей), а также работу с соответствующими базами данных — ныне эта область получила специальное определение — биоинформатика. Следующая группа методов объединяет методики изучения эволюции молекулярных систем с использование эмпирических силовых полей. Набор подходов, позволяющих определять пространственную структуру белковых молекул, учитывая имеющиеся структурные шаблоны белков с гомологичными аминокислотными последовательностями, получил название моделирование на основании гомологии. Наконец, специальные подходы, позволяющие изучать взаимодействия типа лиганд-рецептор или фермент-субстрат, относятся к области молекулярного докинга. Обо всем этом вы узнаете подробнее на страницах раздела «Сухая биология».
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К АНТИБИОТИКАМ:
МЕТОДЫ, РЕЗУЛЬТАТЫ, ОЦЕНКА
Решедько Галина Константиновна,
к.м.н., ассистент кафедры клинической фармакологии
Смоленской государственной медицинской академии
214019, г.Смоленск, ул.Крупской, 28, а/я № 5.
Тел.: +7(0812) 61 13 01, 61 13 27, Факс: (0812) 61 12 94,
E-Mail: galina@antibiotic.ru
Содержание
Резюме
В лекции рассмотрены основные методы определения чувствительности in vitro микроорганизмов к антимикробным препаратам (диско-диффузионный, Е-тестов, методы разведения). Отражены подходы к эмпирическому и этиотропному назначению антибиотиков в клинической практике. Обсуждены вопросы интерпретации результатов определения чувствительности с клинической и микробиологической точек зрения.
В настоящее время в клинической практике существуют два принципа назначения антибактериальных препаратов: эмпирическое и этиотропное. Эмпирическое назначение антибиотиков основано на знаниях о природной чувствительности бактерий, эпидемиологических данных о резистентности микроорганизмов в регионе или стационаре, а также результатах контролируемых клинических исследований. Несомненным преимуществом эмпирического назначения химиопрепаратов является возможность быстрого начала терапии. Кроме того, при таком подходе исключаются затраты на проведение дополнительных исследований.
|
Однако при неэффективности проводимой антибактериальной терапии, при нозокомиальных инфекциях, когда затруднительно предположить возбудителя и его чувствительность к антибиотикам стремятся проводить этиотропную терапию. Этиотропное назначение антибиотиков предполагает не только выделение возбудителя инфекции из клинического материала, но и определение его чувствительности к антибиотикам. Получение корректных данных возможно только при грамотном выполнении всех звеньев бактериологического исследования: от взятия клинического материала, транспортировки его в бактериологическую лабораторию, идентификации возбудителя до определения его чувствительности к антибиотикам и интерпретации полученных результатов.
|
Методы определения чувствительности к антибиотикам
Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам делятся на 2 группы: диффузионные и методы разведения.
Рисунок 1. Определение чувствительности микроорганизмов диско-диффузионным методом.
Определение чувствительности микроорганизма с помощью Е-теста проводится аналогично тестированию диско-диффузионным методом. Отличие состоит в том, что вместо диска с антибиотиком используют полоску Е-теста, содержащую градиент концентраций антибиотика от максимальной к минимальной (рис. 2). В месте пересечения эллипсовидной зоны подавления роста с полоской Е-теста получают значение минимальной подавляющей концентрации (МПК).
Рисунок 2. Определение чувствительности микроорганизмов с помощью Е-тестов.
Несомненным достоинством диффузионных методов является простота тестирования и доступность выполнения в любой бактериологической лаборатории. Однако с учетом высокой стоимости Е-тестов для рутинной работы обычно используют диско-диффузионный метод.
Рисунок 3. Определение значения МПК методом разведения в жидкой питательной среде.
Интерпретация результатов определения чувствительности
На основании получаемых количественных данных (диаметра зоны подавления роста антибиотика или значения МПК) микроорганизмы подразделяют на чувствительные, умеренно резистентные и резистентные (рис. 4). Для разграничения этих трех категорий чувствительности (или резистентности) между собой используют так называемые пограничные концентрации (breakpoint) антибиотика (или пограничные значения диаметра зоны подавления роста микроорганизма).
Рисунок 4. Интерпретация результатов определения чувствительности бактерий в соответствии со значениями МПК.
Существуют два подхода к интерпретации результатов определения чувствительности: микробиологический и клинический. Микробиологическая интерпретация основана на анализе распределения значений концентраций антибиотика, подавляющих жизнеспособность бактерий. Клиническая интерпретация основана на оценке эффективности антибактериальной терапии.
Чувствительные микроорганизмы (susceptible)
Клинически к чувствительным относят бактерии (с учетом параметров, полученных in vitro), если при лечении стандартными дозами антибиотика инфекций, вызываемых этими микроорганизмами, наблюдают хороший терапевтический эффект.
При отсутствии достоверной клинической информации подразделение на категории чувствительности базируется на совместном учете данных, полученных in vitro, и фармакокинетики, т.е. на концентрациях антибиотика, достижимых в месте инфекции (или в сыворотке крови).
Резистентные микроорганизмы (resistant)
К резистентным (устойчивым) относят бактерии, когда при лечении инфекции, вызванной этими микроорганизмами, нет эффекта от терапии даже при использовании максимальных доз антибиотика. Такие микроорганизмы имеют механизмы резистентности.
Микроорганизмы c промежуточной резистентностью (intermediate)
Клинически промежуточную резистентность у бактерий подразумевают в случае, если инфекция, вызванные такими штаммами, может иметь различный терапевтический исход. Однако лечение может быть успешным, если антибиотик используется в дозировке, превышающей стандартную, или инфекция локализуется в месте, где антибактериальный препарат накапливается в высоких концентрациях.
С микробиологической точки зрения к бактериям с промежуточной резистентностью относят субпопуляцию, находящуюся в соответствии со значениями МПК или диаметра зон, между чувствительными и резистентными микроорганизмами. Иногда штаммы с промежуточной резистентностью и резистентные бактерии объединяют в одну категорию резистентных микроорганизмов.
Необходимо отметить, что клиническая интерпретация чувствительности бактерий к антибиотикам является условной, поскольку исход терапии не всегда зависит только от активности антибактериального препарата против возбудителя. Клиницистам известны случаи, когда при резистентности микроорганизмов, по данным исследования in vitro, получали хороший клинический эффект. И наоборот, при чувствительности возбудителя может наблюдаться неэффективность терапии.
В определенных клинических ситуациях, когда недостаточно результатов исследования чувствительности обычными методами, определяют минимальную бактерицидную концентрацию.
Значение МБК используют при терапии антибиотиками, обладающими бактериостатическим действием, или при отсутствии эффекта от антибактериальной терапии у особой категории больных. Частными случаями для определения МБК могут быть, например, бактериальный эндокардит, остеомиелит или генерализованные инфекции у пациентов с иммунодефицитными состояниями.
В заключение хотелось бы отметить, что на сегодняшний день не существует методов, которые позволили бы с абсолютной достоверностью прогнозировать клинический эффект антибиотиков при лечении инфекционных болезней. Однако, данные результатов определения чувствительности могут служить хорошим ориентиром клиницистам для выбора и коррекции антибактериальной терапии.
Таблица 1. Критерии интерпретации чувствительности бактерий