для количественного учета почвенных микроорганизмов используют

МЕТОДЫ ПОЧВЕННОЙ МИКРОБИОЛОГИИ

В микробиологии существует целый ряд методов изучения, культивирования и учета микроорганизмов. Разнообразие методов связано не только с наличием различных экологических групп микроорганизмов, но и с чрезвычайно большим разнообразием способов питания, путей метаболизма представителей микроскопического мира существ, превращения исходных про­дуктов и субстратов, а также со специфическими по­требностями отдельных видов микроорганизмов в оп­ределенных веществах (факторах роста), которых они сами не могут синтезировать.

По способу питания микроорганизмы делятся на:

1. гетеротрофов, использующих готовое органическое вещество (их большинство),

2. автотрофов, способных самостоятельно синтезировать органические вещества из неорганических веществ.

По отношению к молекулярному кислороду мир микроорганизмов делится на:

1. аэробов, живущих и размножающихся только вприсутствии О₂;

2. анаэробов, способных жить в бескислородной среде.
Различаются микроорганизмы и по их отношению к температуре и рН среды.

В зависимости от различного отношения микроор­ганизмов к пище и экологическим факторам для их культивирования приготавливают синтетические пита­тельные среды или используют естественные (молоко, сыворотку крови, картофель, различные соки растений и др.), а также мясопептонный бульон, пивное сусло, вытяжки из почвы, торфа и т. д. Из синтетических сред широко используются определенные наборы хими­ческих веществ, в том числе минеральных для авто­трофов. Среды могут быть жидкими или плотными с добавлением 2 % агар-агара или 20 % желатины.

Аэробов культивируют на стерильной плотной или жидкой питательной среде. В последнем случае используют постоянное аэрирование — продувание стериль­ного воздуха или встряхивание на специальных качал­ках. Среда для анаэробов кипятится и сверху залива­ется не пропускающим воздух маслом или помещается в специальные камеры — анаэростаты с выкаченным воздухом.

Для изучения и количественного учета почвенных микроорганизмов используют лабораторные и полевые методы.

I. Отбор проб для лабораторных исследований на­чинается со стерилизации инструментов, при помощи которых берется проба почвы, посуды, в которой эти пробы доставляются в лабораторию, и питательных сред.

Существуют следующие виды стерилизации:

—автоклавированием в герметически закрываемой камере при 120°С в течение не менее 20 минут горячим паром под давлением;

—фильтрованием через мембранные фильтры из асбеста с целлюлозой или из эфиров целлюлозы; такие фильтры вставляют в колбы (все, естественно, должно быть стерильным) и через них фильтруют жидкость, содержащую микроорганизмы, которые задерживаются на фильтре, а полученный фильтрат оказывается стерильным;

—облучение ультрафиолетовыми лучами или гамма-лучами.

Для изучения микроорганизмов используют чистые и накопительные культуры. В природных условиях микроорганизмы находятся в сложных сообществах, обычно состоящих из многочисленных популяций раз­ных видов. В таких сообществах изучать физиологичес­кие особенности, рост и развитие отдельных видов очень трудно или просто невозможно.

Чистая культура— выращивание одного вида микроорганизма. Такая культура получается в несколь­ко этапов. Делается это в основном двумя методами:

—разведением. При разведении небольшую навеску почвы разводят в сотни тысяч раз стерильной водой, а затем небольшое количество полученного фильтрата высевают на плотную среду и из выросших колоний выделяют чистые культуры.

—капиллярным. Более точный метод получения чистой культуры основан на использовании капилляров. В разведенный фильтрат опускают капилляры с плоскопараллельными стенками и под микроскопом находят то место, где расположена одна микробная клетка. Она затем высевается на стерильную среду.

В дальнейшем создаются благоприятные для дан­ного вида условия: оптимальная температура, аэрация (или отсутствие О₂ для анаэробов), рН среды и т. д. Принимаются меры для предохранения полученной культуры от заражения другими видами микроорганиз­мов. Культура постоянно проверяется на однородность.

Чистые культуры в почвенной микробиологии ис­пользуются редко, так как по активности микроорга­низма в чистой культуре трудно судить об его активно­сти в природной обстановке поля, леса, луга и т. д., где он находится в тесном взаимодействии и взаимной связи с другими организмами.

Накопительной культуройназывают такую куль­туру, в которой резко преобладает один или несколь­ко близких видов микроорганизмов. Она получается путем посева материала с присутствием интересую­щего вида на элективную среду, благоприятную для данного вида или группы видов, и чуждую — для других. Например, берут комочек почвы, в котором, как известно, присутствует множество видов микро­бов, и помещают в среду, не содержащую азота. Есте­ственно, на безазотистой среде могут расти и разви­ваться только такие микроорганизмы, которые способ­ны добывать молекулярный азот из атмосферы, так называемые азотфиксаторы. Через некоторое время другие микроорганизмы погибнут или будут влачить жалкое существование, а азотфиксирующие — про­цветать. Для количественного и качественного учета мик­роорганизмов почвы в лабораторных условиях исполь­зуют:

1.Посевы на плотную питательную среду предусматривают разведение навески почвы дистиллированной стерильной водой обычно в 100 000 раз; из полученной болтушки берется небольшое количество жидкости (1 мл) и наносится на плотную питательную среду. Через 3 — 7 суток на поверхности среды вырастают несколько десятков или сотен колоний. Данный метод дает заниженные результаты, так как питательные среды не могут быть универсальными для всех организмов. Питательную среду в данном случае лучше приготавливать на почвенной вытяжке, предварительно простерилизованной.

2.Метод прямого микроскопирования заключается в непосредственном подсчете под микроскопом числа микроорганизмов в капле почвенной суспензии, предварительно нанесенной на чистое стерильное и обезжиренное предметное стекло, зафиксированной после размазывания над пламенем горелки и окрашенной соответствующим реактивом (карболовым фуксином и др.). При использовании люминесцентного микроскопа мазок с микроорганизмами окрашивается флуорохромом акридином оранжевым. Живые микроорганизмы в ультрафиолете светятся зеленым, а мертвые — красным светом. Этот метод наиболее точный.

Из лабораторных методов определения физиологи­ческой активности почвенных микроорганизмов сле­дует назвать учет выделяемой в процессе дыхания или брожения микроорганизмами СО₂, накопления нитра­тов в среде с аммонийными формами азота (нитрифи­цирующая способность), активности различных фер­ментов, выделяемых микроорганизмами, и некоторые другие. Выделяющаяся при использовании первого метода СО₂ из почвенных образцов, помещенных в гер­метически закрытые колбы, поглощается раствором барита, избыток которого оттитровывается кислотой, обычно соляной. Нитрифицирующую способность оп­ределяют с использованием накопительной культуры со средой С.Н. Виноградского. Стерилизованные колбы со средой засеваются комочками почвы и помещаются в термостат с температурой 25 — 30 °С на 5 — 6 дней.

Наличие азотной и азотистой кислот определяют одним из количественных или качественных методов. Из последних чаще всего используется метод обнару­жения азотной кислоты с помощью реакции с дефиниламином в крепкой серной кислоте: синее окрашива­ние при смешивании реактива с каплей жидкости из накопительной культуры будет свидетельствовать о наличии иона NO₃-. Азотистая кислота обнаруживает­ся с помощью реактива Грисса, с которым она дает красное окрашивание.

Ферментативную активность аэробных целлюлозоразрушающих микроорганизмов можно опреде­лить несколькими методами. Один из них, самый простой, заключается в следующем. Обогащенную KNO₃ навеску почвы увлажняют и помещают в чаш­ку Петри, на дно которой кладут стерильные обеззоленные фильтры. На поверхность почвы, уложенной в виде тонкой пластинки, накладывают фильтроваль­ную бумагу и плотно прижимают ее к поверхности почвенной пластинки. Приготовленные таким обра­зом образцы помещают во влажные камеры на раз­личное время в зависимости от свойств почвы (обыч­но несколько недель и более). По характеру и степени разложения бумаги судят об активности внеклеточных ферментов целлюлозоразрушающих микроорганиз­мов. Подобным образом можно изучать активность других групп микроорганизмов, например пектин- или лигнинразрушающих.

II. Непосредственно в природной обстановке, в том числе в лесу, используют полевые методы учета коли­чества или активности микроорганизмов:

2.Большой интерес представляет метод капиллярных педоскопов Б.В. Перфильева и Д.Р. Габе. Приготавливается набор капиллярных ячеек с прямоугольными каналами. Капилляры заполняют полужидкой агаризованной средой с добавлением перегнойных фульвокислот, составных частей гумуса почвы. Приго­товленные таким образом капилляры закапывают в почву на 1,5 — 2 месяца. В капилляры проникают и раз­виваются характерные для того или иного генетичес­кого горизонта почв сообщества микроорганизмы.

3. Часто микробиологи, занимающиеся изучением почвенных микроорганизмов, используют метод апп­ликаций, который учитывает микробиологическую ак­тивность почвы и отдельных представителей почвен­ного микромира. Для этого полоски бумаги, состоящие, как известно, из целлюлозы или хлопчатобумажного полотна, закрепляют на стекле и закапывают в почву на определенную глубину на срок до трех месяцев. Микробиологическая активность, в данном случае целлюлозоразрушающих микроорганизмов, оценивается по скорости разложения целлюлозы (количеству раз­рушенной ткани или бумаги).

ОСОБЕННОСТИ СТРОЕНИЯ ПРОКАРИОТНЫХ ОРГАНИЗМОВ

В жизни высших растений микроорганизмы раз­личных систематических групп имеют неравноценное значение. Наибольшая роль принадлежит прокариотам.

Клетка прокариот сравнительно с клетками расте­ний характеризуется рядом структурных и функциональ­ных особенностей, которые сводятся к следующему:

—отсутствие ядерной оболочки и оформленного ядра;

—отсутствие обособленных от цитоплазмы органелл;

—слабое развитие мембран: у большинства прокариотных клеток цитоплазматическая мембрана (ЦПМ) является единственной;

—особое строение клеточной стенки.

Большинство бактерий является одноклеточными организмами. Эволюция выработала у них такие адап­тивные механизмы, которые позволяют каждой отдель­ной клетке осуществлять все необходимые жизненные функции, рост, развитие и размножение.

Бактериальная клетка содержит до 80% воды. Ос­тальная часть представлена белками, полисахаридами, липидами, нуклеиновыми кислотами. В сухом веществе клетки они соответственно составляют в среднем 52, 17, 9 и 19 %.

Ультрамикроскопическое строение метки бактерий показано на рис. 5.3. Цитоплазму, окруженную мембраной, называют протопластом. Снаружи от ЦПМ располагаются поверхностные структуры прокариотной клетки: клеточная стенка, слизистые капсулы или чехлы, жгутики, ворсинки.

В связи с особенностями строения клеточной стен­ки бактерии делят на грамположительные и грамотрицательные. Название происходит от способа окраши­вания, предложенного датским ученым X. Грамом: фиксированные клетки бактерий обрабатывают снача­ла реактивом кристаллическим фиолетовым, затем йодом, вследствие чего появляется специфическое окрашивание. При последующей обработке этиловым спиртом у одних бактерий окрашивание исчезает — это грамотрицательные бактерии. Другие бактерии сохраняют окрашенный комплекс, поэтому получили название грамположительных бактерий.

Клеточная стенка прокариот устроена очень слож­но. Основная масса клеточной стенки грамположительных бактерий состоит из гетерополимерного соединения —пептидогликана, остов молекулы которого пред­ставлен чередующимися остатками N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты. Последняя является эфиром N-ацетилглюкозамина и молочной кис­лоты, к карбоксильной группе которой присоединен пептидный «хвост» из нескольких аминокислот, обычно четырех (рис. 5.4.). Эта пептидная цепочка необычна по двум причинам. Во-первых, здесь присутствуют амино­кислоты в D-форме и аминокислоты с двумя аминогруп­пами. Обе аминогруппы этих аминокислот могут обра­зовывать не только пептидные связи между собой, но и дополнительные пептидные связи между гетерополимерными цепями пептидогликана. В образовании пеп­тидных связей обычно участвуют карбоксильная груп­па D-аланина одного тетрапептида и свободная амино­группа другого. Иногда эти связи образуют другие аминокислоты. В образовании пептидных связей уча­ствуют не все пептидные мостики, часть их находится в свободном состоянии или образует ковалентные связи с другими химическими веществами клеточной стенки. Частота таких «сшивок» может быть различной.

Наряду с пептидогликаном в клеточной стенке грамположительных бактерий содержатся полимерные соединения — тейхоевые кислоты, в молекулы кото­рых входит спирт рибит или глицерин. Свободные гидроксилы в молекулах спиртов могут замещаться остатками различных аминокислот, глюкозы и некото­рых других Сахаров. Кроме того, в клеточной стенке этих бактерий в небольших количествах представлены полисахариды, белки и липиды. Все три класса соеди­нений, образующих клеточную стенку, связаны между собой ковалентными связями и представляют собой очень прочную упорядоченную структуру.

Клеточная стенка у грамотрицательных бакте­рий устроена еще более сложно (рис. 5.5.). Она состоит из нескольких слоев: внутренний тонкий слой образо­ван пептидогликаном, наружный слой представляет собой мембрану, состоящую из белков, липидов и по­лисахаридов. Между ними, в периплазматическом пространстве, расположен рыхлый слой белков.

Некоторые бактерии имеют отличия в строении клеточной стенки (метанообразующие, галофильные), другие не имеют ее вовсе (микоплазмы).

Клеточная стенка выполняет ряд физиологических функций:

4) служит местом локализации ряда веществ, напри­мер ферментов у грамотрицательных бактерий в периплазматическом пространстве между двумя мембранами и др.

Защитной функцией обладают и слизистые обра­зования поверхностных структур, состоящие главным образом из особых полисахаридов и реже из полипеп­тидов. Они же могут служить местом запаса воды и питательных веществ и одним из способов взаимной связи между соседними клетками у колониальных микроорганизмов.

Многие прокариоты способны к активному движе­нию. Направленные движения микроорганизмов назы­вают таксисами.В зависимости от действующего фак­тора различают хемо-, аэро-, фототаксисы и др. У разных микробов наблюдаются различные формы дви­жения:

1. Жгутиковое. Жгутики представляют собой много­кратно изогнутые длинные структуры, которые прикреп­лены к ЦПМ. В состав жгутиков входит специфический белок флагеллин. Энергия для движения с помощью жгутиков получается при превращении градиента элек­трохимического потенциала в механическую работу.

2.Извивание. Например, у спирохет вокруг прото­пласта обвивается аксиальная (опорная) нить, состоя­щая из тех же веществ, что и жгутики. Движение спи­рохет происходит за счет вращения аксиальных фиб­рилл в периплазматическом пространстве между пептидогликановым слоем и наружной мембраной. Это вращение создает на поверхности клеточной стенки эластичную волну, благодаря которой спирохеты могут быстро вращаться вокруг своей длинной оси, извивать­ся и передвигаться в жидкой среде по винтовому или волнообразному способу.

3. Скольжение. Некоторые бактерии, не обладающие жгутиками, передвигаются по твердому субстрату за счет скольжения (миксобактерии, нитчатые серобакте­рии и др.). Это слизеобразующие микроорганизмы. Объяснение механизма движения этих бактерий ви­дят в гипотезе бегущей волны.

Цитоплазматическая мембрана (ЦПМ) у многих бактерий является единственной мембраной. На ее долю приходится 8 — 15 % сухой массы клетки. У фототрофных микроорганизмов, использующих энергию солнечного света, и хемоавтотрофных, пользующихся энергией окисления химических веществ, формируют­ся мембранные структуры, тесно связанные с ЦПМ и выполняющие функции фотосинтеза и хемосинтеза. Они получили название внутрицитоплазматических мембран. Химический состав ЦПМ у грамположительных и грамотрицательных бактерий и эукариот прак­тически одинаков.

Цитоплазматическая мембрана бактерий выполня­ет много функций.

2) здесь находятся ферменты, с участием которых происходит образование различных компонентов клеточной стенки;

3) в ЦПМ расположены электронтранспортные цепи фотосинтеза, хемосинтеза, дыхания, анаэробного дыхания и ферментные комплексы, обеспечивающие превращение электрохимической энергии в энергию макроэргов АТФ;

4) ЦПМ участвует в процессах передачи наследственных свойств благодаря закреплению на ней кольцевой ДНК клетки, в поглощении воды и элементов питания.

Типичных органелл, т.е. структур, обособленных от цитоплазмы, у прокариот нет. Среди внутрицитоплаз­матических мембран бактерий следует отметить мезосомы, выполняющие функции энергообмена, а также выделения (секреторные функции). Предположительно с мезосомами связывают компартментацию клеток, обес­печивающую определенную последовательность в ходе различных ферментативных реакций, доставку субстра­тов для синтеза клеточной стенки. К внутрицитоплазматическим структурам относятся тилакоиды пурпурных бактерий, хлоросомы зеленых бактерий и фикобилисомы цианобактерий, выполняющие фотосинтетическую фун­кцию. Хлоросомы в виде продолговатых пузырьков дли­ной 90—150 нм и шириной 25 — 75 нм окружены одно­слойной мембраной толщиной 2 — 3 нм, состоящей толь­ко из молекул белков. Хлоросомы плотно примыкают к ЦПМ. В них содержатся бактериохлорофиллы, роль которых заключается в улавливании квантов света. Фикобилисомы имеют вид гранул диаметром 25 — 55 нм. В них располагаются пигменты белковой природы — фикобилипротеиды, растворимые в воде. Они также способны улавливать энергию солнечного света.

Цитоплазма, состоящая из белков, продуктов обме­на веществ и различных субстратов, носит название цитозоля. Другая часть, структурная, содержит гене­тический аппарат, рибосомы, а у некоторых микроор­ганизмов и внутрицитоплазматические мембраны, и различные включения. Вся цитоплазма насыщена ри­босомами, где осуществляются, как и у высших расте­ний, синтез белка. Рибосомы отличаются от рибосом эукариот своими меньшими размерами. Число рибо­сом в бактериальных клетках зависит от интенсивно­сти биосинтеза белка в них.

Молекула ДНК располагается в определенном ме­сте цитоплазмы и не отделена от нее мембраной, как у эукариот. Поэтому в отличие от последних генетичес­кий аппарат прокариот называют нуклеоидом,а не ядром. Гистоны у большинства бактерий отсутствуют. Лишь недавно гистоноподобные белки, связанные с ДНК, обнаружены у некоторых микоплазм и некоторых цианобактерий. У каждого вида содержание пар азоти­стых оснований А + ТиГ + Цв молекуле ДНК посто­янно и служит важным диагностическим признаком.

Удвоение молекул ДНК предшествует делению прокариотной клетки и начинается в точке прикрепле­ния кольцевой хромосомы к ЦПМ. Здесь расположе­ны ферменты, которые участвуют в процессах репли­кации ДНК. Водородные связи между полинуклеотид-ными нитями разрываются, и на однонитиевых участках, как на матрице, синтезируются комплементарные цепи дочерних молекул ДНК. Параллельно с репликацией ДНК происходит рост мембраны на уча­стке контакта ДНК с ЦПМ, приводя к разделению вновь образовавшихся молекул ДНК и оформлению их в са­мостоятельные хромосомы двух дочерних бактериаль­ных клеток.

Рост бактериальной клетки представляет собой комплекс процессов биосинтеза различных веществ и формирования структурных элементов. В результате роста бактериальная клетка увеличивается в размерах до определенного момента, затем рост ее приостанав­ливается. После репликации ДНК клетка готова к раз­множению путем деления или почкования. Большин­ство грамотрицательных бактерий делится путем пе­ретяжки, а грамположительных — за счет образования поперечной перегородки.

У некоторых фото- и хемосинтетиков недавно най­дены карбоксисомы, имеющие форму многогранника с 4 — 6 сторонами; они окружены однослойной мембра­ной, состоящей из белков. В состав карбоксисом вхо­дят частицы фермента РДФ-карбоксилазы, катализиру­ющей присоединение СО₂к рибулозодифосфату.

У некоторых бактерий, обитающих в воде и в по­чве, имеются аэросомы (газовые вакуоли), которые обес­печивают плавучесть клеток: сжатие аэросом приво­дит к погружению, разбухание — к подъему.

Из запасных включений бактериальных клеток необходимо назвать полисахариды (гликоген, гранулезу и др.), полипептиды, поли- β- оксимасляную кисло­ту, полифосфаты (источники запасного фосфора), от­ложения элементарной серы у серобактерий. Эти вклю­чения могут обособляться от цитоплазмы белковой мембраной, что предохраняет их от преждевременно­го гидролиза.

Цианобактерии устроены еще более сложно. В це­лом они близки к грамотрицательным бактериям. На­ружная мембрана стенки цианобактерии покрыта сли­зистой капсулой или слизистым чехлом у нитчатых форм. Соседние клетки нитчатых цианобактерии свя­заны между собой особыми ультраструктурами, назван­ными микроплазмодесмами, которые обеспечивают непрерывность мембран и цитоплазмы соседних кле­ток. Цитоплазма с нуклеотидом обильно заполнена рибосомами. Фотосинтетический аппарат содержит хлорофилл а (хлорофилл b отсутствует) и каротиноиды, а также фикобилипротеиды — красные и синие пигменты. Цианобактерии осуществляют фотосинтез с выделением кислорода, а в темноте ведут себя как гетеротрофы. Многие из цианобактерии способны к азотфиксации.

Некоторые бактерии в определенных условиях формируют структуры, отличные от обычных вегетатив­ных клеток. В своем большинстве эти видоизмененные клетки способствуют выживаемости отдельных видов в неблагоприятных условиях среды (эндоспоры, цисты), размножению (споры актиномицетов, гормогонии циа­нобактерии) или осуществлению фиксации атмосфер­ного азота (гетероцисты цианобактерии, бактероиды клубеньковых бактерий). Эндоспоры образуются по од­ной внутри цитоплазмы некоторых грамположительных бактерий. Они обладают многослойными очень плотны­ми покровами. Эндоспоры переносят длительное кипя­чение без потери жизнеспособности, высушивание и т. д. Часть грамотрицательных бактерий способна превра­щаться в цисты — клетки с толстыми наружными по­кровами и капсулами, например у азотобактера. В форме цист азотобактер переносит длительное воздействие неблагоприятных внешних факторов.

Источник

Методы количественного учета микроорганизмов.

Методы количественного учета микроорганизмов могут быть прямыми (подсчет клеток под микроскопом, взвешивание) или косвенными. Косвенные методы основаны на измерении параметров, величина которых зависит от количества или биомассы микроорганизмов (число колоний, выросших после посева суспензии клеток на питательную среду, рассеяние или поглощение суспензией света, содержание в ней белка и т. д.). Выбор метода зависит от целей исследования, свойств питательной среды или субстрата, а также особенностей роста и морфологии микроорганизмов.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА КЛЕТОК
МИКРООРГАНИЗМОВ ПОД МИКРОСКОПОМ

Для подсчета клеток микроорганизмов под микроскопом можно использовать счетные камеры, препараты фиксированных и окрашенных клеток, приготовленные на предметных стеклах или мембранных фильтрах. Перечисленные методы позволяют определить общее количество клеток в единице объема (как живых, так и мертвых). Основное ограничение большинства указанных методов –необходимость довольно высоких концентраций клеток в единице исследуемого субстрата.

1.1 Подсчет клеток на фиксированных окрашенных мазках
(метод Виноградского – Брида)

Этот метод применяется в различных модификациях для определения численности микроорганизмов в разнообразных естественных субстратах –почве, загрязненной воде, оптически непрозрачных средах, содержащих нерастворимые в воде компоненты, например, крахмал, соевую муку. Преимущество метода заключается также в том, что фиксированные окрашенные препараты могут долго храниться, поэтому подсчет можно производить в удобное для исследователя время.

1.2 Подсчет клеток в счетных камерах

Метод прямого подсчета клеток микроорганизмов в счетных камерах успешно применяют для определения общего количества микроорганизмов, содержащихся во взвесях (суспензиях).

Метод количественного учета микроорганизмов с помощью счетных камер имеет ограничения применения, связанные с тем, что в счетных камерах проводится учет всех клеток микроорганизмов без их дифференциации на живые и мертвые клетки. Кроме того, счетные камеры могут быть использованы лишь для подсчета относительно крупных объектов –клеток водорослей, дрожжей, спор грибов, микроскопируемых при объективе от 8 до 40´.

Каплю взвеси наносят капилляром или пипеткой на сетку камеры и сверху накрывают чистым покровным стеклом. Жидкость под покровным стеклом должна равномерно без пузырьков распределиться по всей сетки, не выступая в желобок между стенками. Большими пальцами покровное стекло плотно притирают к боковым площадкам камеры до появления картины интерференции (колец Ньютона). Заполненную камеру помещают на предметный столик микроскопа и через 2 минуты микроскопируют с объективом от 8 до 40´ (в поле зрения должны быть отчетливо видны как квадратики, так и клетки микроорганизмов). Подвижные клетки перед заполнением камеры убивают нагреванием или 0,5%-ным раствором формалина.Обычно просчитывают количество клеток в пяти больших квадратах (т. е. в 80 малых), расположенных по диагонали. Учитывают все клетки, размещенные внутри квадрата и на пограничных линиях, если они большей частью лежат внутри квадрата. Клетки, разделенные пограничной линией пополам, считают только на двух из четырех границ квадрата, а клетки, лежащие большей своей половиной вне данного квадрата, совсем не учитывают.

2 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧИСЛА КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМОВ ВЫСЕВОМ НА ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ

2.1 Определение количества клеток высевом на плотные
питательные среды (метод Коха)

Метод широко применяют для определения численности жизнеспособных клеток в различных естественных субстратах и в лабораторных культурах. В его основе лежит принцип Коха, согласно которому каждая колония является потомством одной клетки. Это позволяет на основании числа колоний, выросших после посева на плотную питательную среду определенного объема исследуемой суспензии, судить об исходном содержании в ней клеток микроорганизмов. Результаты количественного определения микроорганизмов, проведенного по методу Коха, часто выражают не в числе клеток, а в условных, так называемых колониеобразующих единицах (КОЕ). Каждая колония на чашке с питательной средой вырастает из одной колониеобразующей единицы, которая может представлять собой бактериальную, дрожжевую клетку, спору, кусочек мицелия актиномицета или гриба.

Определение числа микроорганизмов этим методом включает три этапа: приготовление разведений, посев на плотную среду в чашки Петри и подсчет выросших колоний.

2 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧИСЛА КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМОВ ВЫСЕВОМ НА ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ

2.1 Определение количества клеток высевом на плотные
питательные среды (метод Коха)

Метод широко применяют для определения численности жизнеспособных клеток в различных естественных субстратах и в лабораторных культурах. В его основе лежит принцип Коха, согласно которому каждая колония является потомством одной клетки. Это позволяет на основании числа колоний, выросших после посева на плотную питательную среду определенного объема исследуемой суспензии, судить об исходном содержании в ней клеток микроорганизмов. Результаты количественного определения микроорганизмов, проведенного по методу Коха, часто выражают не в числе клеток, а в условных, так называемых колониеобразующих единицах (КОЕ). Каждая колония на чашке с питательной средой вырастает из одной колониеобразующей единицы, которая может представлять собой бактериальную, дрожжевую клетку, спору, кусочек мицелия актиномицета или гриба.

Определение числа микроорганизмов этим методом включает три этапа: приготовление разведений, посев на плотную среду в чашки Петри и подсчет выросших колоний.

Метод серийных разведений заключается в том, что в большие или малые бактериологические пробирки разливают соответственно либо по 9, либо по 4,5 мл стерильной водопроводной воды Или стерильного физиологического раствора. Пробирки нумеруют и в первую пробирку вносят 1,0 мл инокулята (если пробирка большая) или 0,5 мл инокулята (если пробирка маленькая). Затем после перемешивания, в том же объеме, каждый раз (обязательно!) новой пипеткой инокулят переносят в следующую пробирку. Количество пробирок в ряду, а следовательно, разведений зависит от предполагаемой микробной загрязненности объекта.

Из полученных разведений делают пересев на плотную питательную среду в чашки Петри методом Коха или Дригальского, причем количество параллельно засеваемых чашек должно быть не менее двух.

При пересеве методом Коха из пробирки с соответствующим разведением стерильной пипеткой набирают 1,0 мл инокулята и выливают на дно пустой стерильной чашки Петри и заливают ее 15-20 мл расплавленным питательным агаром, остуженным до температуры 40°С-45°С. Не поднимая чашки от стола, плавными круговыми движениями перемешивают исследуемый материал со средой, закрывают крышкой и оставляют до застывания среды. После застывания среды чашку переворачивают кверху дном и термостатируют при оптимальной температуре.

Засеянные чашки Петри термостатируют при температуре, оптимальной для исследуемых микроорганизмов и через определенное время проводят подсчет выросших колоний. Для подсчета берут то разведение, при котором в чашке выросло от 100 до 300 колоний, хорошо отделенных друг от друга.

Подсчет выросших колоний проводят, не открывая чашки Петри, перевернув их кверху дном. Каждую отсчитанную колонию отмечают точкой с помощью стеклографа или перовой авторучки. Для оптимизации процесса счета колоний используют прибор для счета колоний, который снабжен осветительным устройством, лупой, светофильтрами, сеткой на круглом стекле, перовой ручкой и счетчиком.

Среднее число колоний, образуемых на чашках с агаром, почти всегда пропорционально числу бактерий в инокулуме, т.е. одна единица бактерий образует одну колонию. Но в некоторых случаях (негомогенное распределение клеток микроорганизмов, слипание микроорганизмов, прилипание к стеклу, явление антагонизма и др.) число колоний может быть иным, нежели содержание бактерий в инокулуме. Поэтому принято говорить не о числе микроорганизмов в инокулуме, а о количестве колонии образующих единиц (КОЕ). Этот термин является официальным и употребляется в нормативных документах, определяющих методики микробиологических исследований и допустимые значения присутствия микроорганизмов в объектах окружающей среды.

Зная степень серийного разведения и количество выросших колоний, подсчитывают количество КОЕ в 1 мл исходного инокулята по формуле:

,

Источник