Экспрессия цитокератина 7 что значит

Экспрессия цитокератина 7 и цитокератина 19 при высокой степени интраэпителиального поражения шейки матки и плоскоклеточной карциноме и их возможное участие в цервикальном канцерогенезе

Актуальность:

Вирус папилломы человека высокого риска (ВПЧ ВР) поражает клетки в переходной зоне (ПЗ) шейки матки, вызывая рак. Цитокератин (СК) 7 является маркером ПЗ и окрашивает клетки при цервикальной неоплазии. CK19 является обязательным «партнером» CK7 и экспрессируется при раке шейки матки. Несмотря на возможную связь между CK7/CK19 и раком шейки матки, не так много известно о механизме вовлечения CK7/CK19 при цервикальном канцерогенезе, опосредованном ВПЧ ВР.

Методы:

Был выполнен анализ экспрессии CK7, CK19, и р16 с помощью иммуногистохимического метода и ВПЧ-инфекции методом гибридизации in situ в 25 случаях высокой степени интраэпителиального поражения шейки матки (CIN3) и в 30 случаях плоскоклеточной карциномы (SCC).

Результаты:

Экспрессия CK19, р16 и ВПЧ была положительной во всех случаях CIN 3 и SCC. Экспрессия CK7 была положительной во всех случаях CIN 3 и в 66% (n=20 из 30) SCC. Для каждого белка было характерно диффузное или очаговое окрашивание с топографическими различиями. Очаговое окрашивание CK7 и эписомальной ДНК ВПЧ совпадали в верхних слоях CIN3 и центральной части участка при SCC. В то время как очаговое окрашивание CK19 и комплексной ДНК ВПЧ обычно отмечалось в нижних слоях CIN 3 и по периферии участка SCC. Очаги окрашивания р16 совпадали с CK19 у пациенток с SCC.

Заключение:

Ключевые слова:

СК 19; СК 7; рак шейки матки; ВПЧ; зона перехода; р16

Cytokeratin7 and cytokeratin19 expression in high grade cervical intraepithelial neoplasm and squamous cell carcinoma and their possible association in cervical carcinogenesis.

Источник

Экспрессия цитокератина 7 что значит

Нейроэндокринноклеточные опухоли (НЭО) – это разнородная группа новообразований, происходящих из нейроэндокринных клеток, способных к продукции гормонов и других веществ, обладающих биологически активными свойствами [1]. Научный интерес к проблеме нейроэндокринных новообразований возрастает с каждым годом. Эта тенденция во многом связана с увеличением частоты их обнаружения относительно опыта прошлых лет, что может быть обусловлено широким внедрением в практику современных методов диагностики, повышенной онкологической настороженностью, а также абсолютным стремительным ростом заболеваемости НЭО под влиянием изменяющихся факторов внешней среды в условиях урбанизации [2]. За последние 30 лет отмечается значительное увеличение числа новых зарегистрированных случаев заболеваемости НЭО всех локализаций [2; 3]. Так, на сегодняшний день заболеваемость НЭО составляет 5,25 случая НЭО на 1 миллион населения в год [4]. Хотя НЭО могут встречаться во всех органах, где есть нейроэндокринные клетки, большая часть из них приходится именно на желудочно-кишечный тракт (61%), и не менее 40% от этого количества составляют НЭО поджелудочной железы (ПЖ) [4; 5]. По данным литературы, последние выявляются с частотой 3-5 случаев на 1 млн населения в год [6]. Одна из главных проблем НЭО ПЖ в Российской Федерации сводится к отсутствию единого регистра этих опухолей, в связи с чем нет достоверных данных о заболеваемости ими в нашей стране [7].

Долгое время НЭО оставались предметом многочисленных дискуссий по поводу представлений об их истинной биологии. С 1907 года, после того как Oberndorfer ввел термин «карциноид», считалось, что НЭО имеют доброкачественную природу [8]. Однако благодаря развитию электронной микроскопии, иммуногистохимическим и молекулярно-биологическим методам исследования было установлено, что НЭО – это группа опухолей с неопределенным злокачественным потенциалом, способных в отдаленные сроки после операции рецидивировать и метастазировать [9]. Этот факт произвел настоящую революцию во взглядах ученых на проблему НЭО. Был сделан вывод, что, несмотря на сходные особенности в отношении морфологического строения, НЭО ЖКТ и ПЖ представляют собой гетерогенную группу, внутри которой существует множество различий как на клиническом уровне, так и на молекулярном. Данное обстоятельство определяет необходимость дифференцированного подхода к ведению пациентов с НЭО. Важное значение в диагностике НЭО ПЖ имеют морфологическое и иммуногистохимическое исследования, которые позволяют с высокой точностью установить потенциал злокачественности опухолей и на этом основании определить тактику лечения и сделать соответствующие прогнозы [9; 10].

Классификация НЭО ПЖ претерпела множество изменений, и в настоящее время рекомендовано использовать новую классификацию ВОЗ НЭО ПЖ от 2017 года, где основным фактором для определения злокачественности (Grade) также считается уровень индекса пролиферативной активности Ki-67 (Ki-67 ≤2 – G1, Ki-67 3–20% – G2, Ki-67 > 20% – G3), но новая концепция предполагает выделение высокодифференцированных НЭО ПЖ (G1, G2, G3), низкодифференцированных нейроэндокринных карцином (G3), в том числе их крупно- и мелкоклеточные варианты, смешанных карцином (MiNEN) [10]. Иммуногистохимический анализ, в свою очередь, позволяет подтвердить нейроэндокринную природу опухоли и уточнить ее гормональный статус.

Лечение НЭО ПЖ, как и их диагностика, требует мультидисциплинарного подхода. Это значит, что хирургическое лечение в иных случаях необходимо сочетать с химиотерапевтическими препаратами (особенно при низкодифференцированных карциномах) и препаратами из группы аналогов соматостатина. Применение последних является наиболее перспективным направлением в современной онкологии, но перед их назначением требуется иммуногистохимическое подтверждение экспрессии специфических рецепторов к соматостатину (SSTR2) на клетках опухоли [10]. В настоящее время нет достоверных данных о характере экспрессии данных рецепторов в различных органах и тканях, поэтому для изучения этого вопроса необходимы дальнейшие исследования с большими и репрезентативными выборками. Все вышеперечисленное обуславливает высокую актуальность проблемы НЭО ПЖ.

Цель исследования. Проанализировать иммунофенотипические особенности НЭО ПЖ, выраженность экспрессии диагностически значимых маркеров (Ki-67, синаптофизин, CD-56, NSE, Хромогранин А, CK-7, CK-18, CK-20, АЕ1/АЕ3) и оценить отдаленные результаты хирургического лечения.

Полученные результаты ИГХ-исследования экспрессии девяти маркеров представлены в таблице 1.

Характеристика экспрессии исследованных маркеров в образцах НЭО ПЖ

Источник

Экспрессия цитокератинов в опухолях щитовидной железы

В.В. ХАЗИЕВ

Институт проблем эндокринной патологии им. В.Я. Данилевского НАМН Украины, 61002, Украина, г. Харьков, ул. Артема, д. 10

Хазиев Вадим Витальевич — кандидат медицинских наук, заведующий отделением эндокринной хирургии и гинекологии, e-mail: khaziev@mail.ru¹

Исследовалась экспрессия цитокератинов СК7, СК20, СК34bЕ12препаратах фолликулярных аденом, 16 препаратах фолликулярного рака и 19 препаратах папиллярного рака щитовидной железы. Для фолликулярных аденом характерной была экспрессия СК7 (83,33%) и отсутствие экспрессии СК34bЕ12. Препараты фолликулярного рака экспрессировали СК7 в 100% случаев. СК20 и СК34bЕ12не определялись ни в одном из препаратов. Отсутствие экспрессии СК7, высокая частота определения СК20 и СК34bЕ12(89,47-94,74%) были характерными для папиллярного рака щитовидной железы. Сопоставление полученных данных может быть полезным для дифференциальной диагностики фолликулярных неоплазий.

Ключевые слова: цитокератины, щитовидная железа, фолликулярная аденома, папиллярный рак, фолликулярный рак.

V.V. KHAZIEV

Institute of Endocrine Pathology named after V.J. Danilevsky NAMS of Ukraine, 10 Artema St., Kharkiv, the Ukraine 61002

Expression of cytokeratins in in tumors of the thyroid gland

KhazievV.V. — Candidate of Medical Science, Head of the Department of Endocrine Surgery and Gynecology, e-mail: khaziev@mail.ru¹

The expression of cytokeratins СK7, СK20, СК34Е12 was studied in 24 follicular adenomas drugs, 16 follicular cancers drugs and 19 papillary thyroid cancers drugs. Expression of СK7 (83.33%) and lack of expression of СК34Е12 was characteristic for follicular adenomas. Follicular cancer drugs had CK7 expression in 100% of cases and CK20 and СК34Е12 were not detected. Lack of CK7 expression, high frequency of CK20 and СК34Е12 definition (89,47-94,74%) was typical for papillary thyroid cancer. Comparison of the data may be useful for differential diagnosis of thyroid follicular neoplasia.

Key words: cytokeratins, thyroid, follicular adenoma, papillary carcinoma, follicular carcinoma.

Проблема диагностики злокачественных новообразований щитовидной железы (ЩЖ) связана не только и не столько с морфологическими и клиническими особенностями самих опухолей, сколько с недостаточным знанием биологической сущности новообразований. В последние годы предприняты попытки использования современных методов иммуногистохимии и молекулярной биологии для раскрытия молекулярно-генетических механизмов развития опухолей, уточнения их злокачественности и оценки прогноза 6.

С целью решения проблем дифференциальной диагностики эффективным считается определение цитокератинов (cytokeratins — СК). Термин «цитокератин» был введен в конце 1970-х годов, когда были идентифицированы белки, из которых построены внутриклеточные промежуточные филаменты 13. Определено более 20 различных СК, отличающихся по аминокислотному составу, молекулярному весу и изоэлектрической точке. Для разных типов эпителия характерны определенные группы СК [14]. Фолликулярный эпителий, относящийся к простым однослойных, всегда содержит СК7, 8, 18 и 19. Те же СК находят в эпителии всех типов доброкачественных и злокачественных новообразований ЩЗ 17. В папиллярных карциномах в местах плоскоклеточной метаплазии находят СК1, 5, 6, 13, характерные для многослойного плоского эпителия. Эти же СК присутствуют в трабекулярных гиалинизированных аденомах [18].

Таблица.

Частота и выраженность экспрессии цитокератинов 7, 20 та 34bЕ12 в опухолях щитовидной железы

Примечание: «–» — нет экспрессии;

Известно также, что малигнизации эпителиальных клеток может приводить к изменению спектра СК, присущего эпителию определенной локализации [19]. Этот феномен мог бы быть использован в качестве маркера малигнизации. Учитывая это, разными группами исследователей изучался состав СК нормального тиреоидного эпителия по сравнению с эпителием доброкачественных и злокачественных новообразований ЩЖ. В результате исследований получены данные о исключительной экспрессии СК19 в фолликулярном эпителии 92% папиллярных карцином и 3% доброкачественных новообразований [20]. На этом основании сделан вывод о высокой эффективности использования СК19 в качестве маркера папиллярных карцином [21]. Между тем существуют противоположные данные. Так, в фундаментальном исследовании Dockhorn-Dworniczak B. и соавторов обнаружено, что экспрессия СК19 с высокой частотой проявляется как в карциномах, так и в доброкачественных новообразованиях ЩЖ [22]. Другие исследователи наблюдали СК19 в эпителии нормальной ЩЖ, в 100% папиллярных карцином, 50% фолликулярных аденом, 72,7% гиперпластических узловых зобов и аутоиммунного тиреоидита [23, 24].

Цель данного исследования — определение экспрессии цитокератинов иного спектра (СК7, 20, 34bЕ12) в качестве критериев дифференциальной диагностики фолликулярных неоплазий ЩЖ.

Материалы и методы

Для исследования экспрессии СК в фолликулярных неоплазиях ЩЖ определялись СК7 (призматический эпителий) (клон ВА4, DakoCytomation), СК20 (клон ВА17, DakoCytomation) и СК высокой молекулярной массы как показательных маркеров с моноклональным антителом 34bЕ12 (СК1, 5, 10 и 14) (клон 34βЕ12, DakoCytomation).

Иммуногистохимическому исследованию подлежали 24 препарата тиреоидных фолликулярных аденом, 16 препаратов фолликулярного рака ЩЖ (ФРЩЖ), 19 препаратов папиллярного рака щитовидной железы (ПРЩЖ).

Срезы толщиной 4-5 мкм наносили на предметные стекла, предварительно обработанные адгезивной жидкостью (poly-L-lysine) с последующей депарафинизацией в соответствии cпринятыми стандартами. Для каждого маркера выполнялись контрольные исследования с целью исключения ошибочно положительного или ложно отрицательного результата. Дальнейшую обработку проводили с использованием систем визуализации LSAB2 и LabVision (UltraOne) в течение 10 минут с каждым реагентом с промежуточным промывкой в ​​Трис-буферном растворе. После этого проводили реакцию с хромогеном (DAB (DakoCytomation)), микроскопически оценивая качество взаимодействия на протяжении от 20 сек. до 3 мин. Для дифференцировки структур тканей срезы дополнительно окрашивались гематоксилином Майера в течение 3 мин. Дегидратация и заливка в бальзам осуществлялись согласно известным принципам. Результат оценивали как положительный при выпадении солей хромогена именно в опухолевых клетках, причем в виде специфической реакции (мембранной или реакции цитоплазмы). Клетки, которые были положительными относительно экспрессии маркеров, изучались как минимум на 4-6 случайно выбранных полях зрения с использованием объективов х10 и х40. После подсчета 300 гистологически идентифицированных объектов (ядер или клеток) вычисляли показатели экспрессии по результатам всех изученных участков. Учитывалась положительная реакция в нормальных и опухолевых клетках фолликулярного тиреоидного эпителия.

Оценка иммуногистохимической реакции основывалась на интенсивности окраски и распределении имунопозитивных клеток по шкале: «-» — нет экспрессии, «+» — слабая экспрессия, «+ +» — умеренная экспрессия, и «+ + +» — интенсивное окрашивание.

Результаты исследования

В фолликулярных аденомах ЩЖ наблюдалась умеренная локусная экспрессия только на СК7 (20 случаев; 83,3%) (рис. 1). СК20 слабо экспрессировался в отдельных локусах опухолевой ткани (6 случаев; 25,0%) (рис. 2). Антитела к высокомолекулярным цитокератинам (клон 34bЕ12) не экспрессировались ни в одном из исследуемых случаев фолликулярных аденом ЩЖ.

Изучалась присутствие низкомолекулярного СК7 в материале ФРЩЖ. Антитела к СК7 реагировали в 100% представленных случаев, однако с разной степенью интенсивности: от слабоположительной локальной реакции до умеренного диффузного окрашивания опухолевой ткани. Что касается цитокератинов высокой молекулярной массы (СК20 и клон 34bЕ12), то в исследованных случаях экспрессия данных маркеров отсутствовала, что соответствует имеющимся литературным данным.

При исследовании ПРЩЖ, как обычного типа, так и его фолликулярного варианта, выявлено, что 94,7% случаев папиллярной карциномы, включая фолликулярный вариант, были положительны на СК20 (рис. 3). Интенсивность окрашивания колебалась от умеренной до ярко-выраженной, но во всех случаях определялась равномерная экспрессия во всей опухолевой ткани.

При определении присутствия высокомолекулярных СК34bЕ12обнаружено, что антитела реагировали с 89,5% ПРЩЖ, включая его фолликулярный вариант. В целом участки окрашивания в ПРЩЖ были выраженными и равномерными (рис. 4).

Таким образом, данные по экспрессии СК7, 20 и 34bЕ12предоставляют возможность подтвердить гипотезу о наличии уникального спектра цитокератинов для каждой из опухолевых форм патологии фолликулярного эпителия ЩЖ, что может быть полезным для дифференциальной диагностики тиреоидных неоплазий.

Выводы

1. Для фолликулярных аденом ЩЖ характерной была экспрессия СК7 (83,33%) и отсутствие экспрессии СК34bЕ12.

2. Препараты фолликулярного рака ЩЖ экспрессировали СК7 в 100% случаев. СК20 и СК34bЕ12не определялись ни в одном из препаратов.

3. Отсутствие экспрессии СК7, высокая частота определения СК20 и СК34bЕ12(89,47-94,74%) были характерными для папиллярного рака ЩЖ.

4. Сопоставление полученных данных может быть полезным для дифференциальной диагностики фолликулярных неоплазий.

1. Абросимов А.Ю., Шкурко О.А. Анализ экспрессии циклина D1 в папиллярных микрокарциномах щитовидной железы. // Российский онкологический журнал. — 2008. — № 3. — С. 26-30.

2. Fukushima M., Ito Y., Hirokawa M. et al. Macrofollicular variant of papillary thyroid carcinoma: its clinicopathological features and long-term prognosis. // Endocr. J. — 2009. — Vol. 56, № 3. — P. 503-8.

3. Eszlinger M., Krohn К., Hauptmann S. et al. Perspectives for improved and more accurate classification of thyroid epithelial tumors // J. Clin. Endocrinol. Metab. — 2008. — Vol. 93, № 9. — P. 3286-3294.

4. Foukakis Т., Gusnanto A., Au A.Y.M. et al. A PCR-based expression signature of malignancy in follicular thyroid tumors // Endocrine-Related Cancer. — 2007. — Vol. 14, № 2. — P. 381-391.

5. Niedziela M., Maceluch J., Korman E. Galectin-3 is not an universal marker of malignancy in thyroid nodular disease in children and adolescents // J. Clin. Endocrinol. Metab. — 2002. — Vol. 87, № 9. — P. 4411-4415.

6. Zeiger M.A., Dackiw A.P. Follicular thyroid lesions, elements that affect both diagnosis and prognosis // J. Surg. Oncol. — 2005. — Vol. 89, № 3. — P. 108-13.

7. Asa S. The role of immunohistochemical markers in the diagnosis of follicular patterned lesions of the thyroid // Endocrine Pathol. — 2005. — Vol. 16. — P. 295-309.

8. Casey M.B., Lohse C.M., Lloyd R.V. Distinction between papillary thyroid hyperplasia and papillary thyroid carcinoma by immunohistochemical staining for cytokeratin 19, galectin 3 and HBME 1 // Endocrine Pathol. — 2003. — Vol. 14. — P. 55-60.

9. Kim K.H., Suh K.S., Kang D.W., Kang D.Y. Mutations of the BRAF gene in papillary thyroid carcinoma and in Hashomoto’s thyroiditis // Pathol. Int. — 2005. — Vol. 55, № 9. — P. 540-545.

10. Sack M., Astengo-Osuna C., Lin B.T. et al. HBME-1 immunostaining in thyroid fine needle aspirations: a useful marker in the diagnosis of carcinoma // Modern Pathol. — 1997. — Vol. 10. — P. 668-674.

11. Williams E.D. Two proposals regarding the terminology of thyroid tumors // Int. J. Surg. Pathol. — 2000. — Vol. 8, № 3. — P. 181-183.

12. Franke W.W., Schmid E., Osborn M., Weber K. Intermediate-sized filaments of human endothelial cells // J Cell Biol. — 1979. — Vol. 81, № 3. — Р. 570-580.

13. Raphael S.J. et al. Brief report: detection of high-molecular-weight cytokeratins in neoplastic and non-neoplastic thyroid tumors using microwave antigen retrieval / Modern Pathol. — 1995. — Vol. 8, № 8. — Р. 870-872.

14. Moll R., Franke W.W., Schiller D.L. et al. The catalog of human cytokeratins polypeptides: Pattern of expression in normal epithelia, tumors and cultured cells // Cell. — 1982. — Vol. 31. — Р. 11-24.

15. Dockhorn-Dworniczak B., Franke W.W., Schroder S., Czernobilsky B., Gould V. E., Boecker W. Patterns of expression of cytoskeletal proteins in human thyroid gland and thyroid carcinomas // Differentiation. — 1987. — Vol. 35‚ № 1. — Р. 53-71.

16. Fonseca E.‚ Nesland J.M.‚ Hoeie J.‚ Sobrinho-Simoes M. Pattern of expression of intermediate cytokeratin filaments in the thyroid gland: an immunohistochemical study of simple and stratified epithelial-type cytokeratins // Virchows Archiv. — 1997. — Vol. 430‚ № 3. — P. 239-245.

17. Fonseca E.‚ Nesland J.M.‚ Sobrinho-Simoes M. Expression of stratified epithelial-type cytokeratins in hyalinizing trabecular adenomas supports their relationship with papillary carcinomas of the thyroid // Histopathology. — 1997. — Vol. 31‚ № 4. — Р. 330-335.

18. Зелинская А.В.‚ Божок Ю.М. Использование иммуноцитохимического выявления детерминант цитокератина №17 в дооперационной цитологической диагностике злокачественных новообразований щитовидной железы // Онкология. — 2000. — Т. 2‚ № 1-2. — С. 56-60.

19. Baloch Z.W.‚ Abraham S.‚ Roberts S.‚ LiVolsi V. A. Differential expression of cytokeratins in follicular variant of papillary carcinoma: an immunohistochemical study and its diagnostic utility // Human Pathology. — 1999. — Vol. 30‚ № 10. — Р. 1166-1171.

20. Nasser S.M., Pitman M.B., Pilch B.Z., Faquin W.C. Fine-needle aspiration biopsy of papillary thyroid carcinoma: Diagnostic utility of cytokeratin 19 immunostaining // Cancer. — 2000. — Vol. 90‚ № 5. — Р. 707-311.

21. Dockhorn-Dworniczak B., Franke W.W., Schroder S. et al. Patterns of expression of cytoskeletal proteins in human thyroid gland and thyroid carcinomas // Differentiation — 1987. — Vol. 35‚ № 1. — Р. 53-71.

22. Fonseca E.‚ Nesland J. M.‚ Hoeie J.‚ Sobrinho-Simoes M. Pattern of expression of intermediate cytokeratin filaments in the thyroid gland: an immunohistochemical study of simple and stratified epithelial-type cytokeratins // Virchows Archiv. — 1997. — Vol. 430‚ № 3. — Р. 239-245.

23. Rafael S.J., McKeown-Eyssen G., Asa S.L. High-molecular-weight cytokeratin and cytokeratin-19 in the diagnosis of thyroid tumors // Modern Pathol. 1994. — Vol. 7, № 3. — Р. 295-300.

1. Abrosimov A.Yu., Shkurko O.A. Analysis of cycline DI expression in thyroidal papillary microcarcinomas. Rossiyskiy onkologicheskiy zhurnal, 2008, no. 3, pp. 26-30. (in Russ.).

2. Fukushima M., Ito Y., Hirokawa M., et al. Macrofollicular variant of papillary thyroid carcinoma: Its clinicopathological features and long-term prognosis. Endocrine Journal, 2009, vol. 56, no. 3, pp. 503-508. DOI: 10.1507/endocrj.K08E-346.

3. Eszlinger M., Krohn К., Hauptmann S., et al. Perspectives for improved and more accurate classification of thyroid epithelial tumors. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 2008, vol. 93, no. 9, pp. 3286-3294. DOI: 10.1210/jc.2008-0201.

4. Foukakis Т., Gusnanto A., Au A.Y.M., et al. A PCR-based expression signature of malignancy in follicular thyroid tumors. Endocrine-Related Cancer, 2007, vol. 14, no. 2, pp. 381-391. DOI: 10.1677/ERC-06-0023.

5. Niedziela M., Maceluch J., Korman E. Galectin-3 is not an universal marker of malignancy in thyroid nodular disease in children and adolescents. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 2002, vol. 87, no. 9, pp. 4411-4415. DOI: 10.1210/jc.2002-020387.

6. Zeiger M.A., Dackiw A.P.B. Follicular thyroid lesions, elements that affect both diagnosis and prognosis. Journal of Surgical Oncology, 2005, vol. 89, no. 3, pp. 108-113. DOI: 10.1002/jso.20186.

7. Asa S. The role of immunohistochemical markers in the diagnosis of follicular patterned lesions of the thyroid. Endocrine Pathology, 2005, vol. 16, no. 4, pp. 295-309. DOI: 10.1385/EP:16:4:295.

8. Casey M.B., Lohse C.M., Lloyd R.V. Distinction between papillary thyroid hyperplasia and papillary thyroid carcinoma by immunohistochemical staining for cytokeratin 19, galectin-3 and HBME-1. Endocrine Pathology, 2003, vol. 14, no. 1, pp. 55-60. DOI: 10.1385/EP:14:1:55.

9. Kim K.-H., Suh K.-S., Kang D.-W., Kang D.-Y. Mutations of the BRAF gene in papillary thyroid carcinoma and in Hashomoto’s thyroiditis. Pathology International, 2005, vol. 55, no. 9, pp. 540-545. DOI: 10.1111/j.1440-1827.2005.01866.x.

Источник