Шиповидный белок коронавируса что это такое

Ученые раскрыли механизм заражения клеток коронавирусом

Группа немецких ученых из Европейской лаборатории молекулярной биологии (EMBL) в Гейдельберге, Института биофизики Макса Планка, Института Пауля Эрлиха и Франкфуртского университета Гете провела исследование частиц коронавируса SARS-CoV-2, вызывающего пневмонию COVID-19. Результаты исследования они опубликовали в журнале Science, его результаты описывает портал Phys.org.

Ученые сконцентрировались на изучении поверхности вируса SARS-CoV-2, на которой расположены «шипы» — выросты, благодаря которым этот тип вирусов получил название «коронавирус». Исследование проводилось с помощью метода криоэлектронной томографии, при котором образцы замораживают до сверхнизких температур, после чего изучают с помощью электронных микроскопов.

В среднем на поверхности частиц SARS-CoV-2 находится до 40 «шипов», следует из исследования. С их помощью вирус прикрепляется к клетке, которую он в дальнейшем заражает. Таким образом, шипы выполняют две основные функции — прикрепление к клеточным рецепторам и в дальнейшем слияние с клеточной мембраной для того, чтобы проникнуть внутрь клетки.

Ранее предполагалось, что шипы соединены с частицами вируса жестким «стеблем», однако ученые установили, что в реальности они гибкие и способны двигаться. Каждый «шип» состоит из трех образований, который исследователи, по аналогии с обычными конечностями, назвали «бедром», «коленом» и «голеностопом». Гибкость «шипов» упрощает им задачу по прикреплению к поверхности клеток организма-хозяина.

«Как будто воздушные шары на веревочках, «шипы» движутся по поверхности вируса и таким образом могут искать место для прикрепления к клетке-цели», — объясняет Жакомин Криньсе-Локер, глава исследовательской группы в Институте Пауля Эрлиха.

Обычно «шипы» коронавируса являются целью для антител зараженного организма, которые, атакуя их, пытаются предотвратить проникновение в клетки. Однако у коронавируса SARS-CoV-2 «шипы» покрыты молекулами гликанов (полисахаридов). Они образуют защитную оболочку, которая скрывает «шипы» от антител.

«Шипы» коронавируса — это особый тип белков. Эти белки используются в качестве составляющей ряда разрабатывающихся вакцин от SARS-CoV-2. Ученые рассчитывают, что исследование их особенностей позволит сделать новый шаг в разработке вакцин.

Ранее ученые из Испании и Бразилии опубликовали исследование, согласно которому люди с отрицательным резус-фактором (Rh–) могут чаще заражаться коронавирусной инфекцией. Исследование показало и значительную корреляцию между заболеваемостью COVID-19 и группами крови, в частности прямую связь со второй положительной группой крови (А+). При этом наблюдалась обратная зависимость с третьей положительной группой крови (В+), то есть чем выше заболеваемость, тем ниже сравниваемый показатель у людей с третьей положительной.

Согласно последним данным ВОЗ, всего в мире выявлено более 21,9 млн случаев заражения новой коронавирусной инфекцией. Умерли 775,5 тыс. человек.

Источник

Тайна шиповидного белка: коронавирус лишат ключа к организму

Ученые уже подводят некоторые итоги пандемии коронавируса COVID-19, назван наиболее пострадавший от коронавируса город мира. Это итальянский Бергамо. Там с 20 февраля по конец марта смертность увеличилась на 568 процентов. При этом у местных жителей и самый высокий уровень антител, почти у 57 процентов они обнаружены. Правда, российские специалисты утверждают, что важно выяснить, есть ли у человека, перенесшего COVID-19, особый тип антител к шиповидному белку, дающему вирусу ключ к организму.

Среди людей, у которых уже есть антитела к коронавирусу, ученые теперь ищут тех, у кого защита от инфекции максимальна. Это имеет огромное значение для науки и медицины. А возможным это стало благодаря тестам, которые придумали в институте Гамалеи. Массовые анализы на антитела, которые используют для скрининга коллективного иммунитета, достоверно говорят лишь о том, встречался ли организм с вирусом. На устойчивость к инфекции указывают антитела особые. Они вырабатываются к S-белку в короне вируса, за счет которого он проникает в клетки. Если иммунная система умеет блокировать S-белок, патоген просто не может зайти в клетку, а значит точно не вызовет болезнь.

«Наличие этих антител в крови исследуемого пациента говорит о том, что данный человек будет защищен от вируса, если он с ним в последующем встретится», — поясняет директор НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Н. Гамалеи Александр Гинцбург.

Редкие кадры: в мешке ученые искусственно выращивают те самые белки коронавируса. Затем их наносят на планшет. И в каждую лунку добавляют плазму пациентов. Если антитела к белку есть, то реагент изменит цвет.

«Мы взяли этот белок как мишень и при помощи иммунно-ферметного анализа (ИФА) ведем поиск, есть ли у человека в крови такие антитела, которые способны заблокировать проникновение вируса в клетки», — рассказывает заведующий лабораторией иммунно-биотехнологии НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Н. Гамалеи Александр Щебляков.

Новая тест-система уже активно используется в больницах. С ее помощью оценивают плазму доноров, которую потом переливают самым тяжелым пациентам. Выбирают именно ту кровь, которая точно окажет лечебный эффект.

«Мы начали проводить отбор доноров по содержанию этих антител, а потом уже приглашать и на донацию. Только плазма с высоким содержанием антител, как мы считаем, окажет максимальный клинический эффект», — добавляет заведующий отделением клинической, производственной трансфузиологии и гравитационной хирургии крови ГБУЗ «НИИ СП имени Н.В. Склифосовского» Александр Костин.

А еще новые тесты нужны для оценки эффективности вакцины. Если в доклинических испытаниях привитых мышей просто заражали вирусом и наблюдали, то в клинических тестах на добровольцах, первыми из которых стали разработчики, новые тесты станут главным подтверждением того, что вакцина работает.

«У нас есть защитные титры, у разработчиков. Когда мы получим разрешение на испытание вакцины, мы будем использовать свою тест-систему для оценки эффективности этой вакцины для того, как вы уже совершенно верно сказали, чтобы не заражать людей», — подчеркивает директор НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Н. Гамалеи Александр Гинцбург.

Разрешение на клинические испытания вакцины ожидают получить со дня на день. Если они пройдут успешно, то уже к осени разработку можно будет запускать в массовое производство. Остается надеяться, что вторая волна не начнется раньше. Шансы есть.

«Под действием солнечного излучения, которое в том числе содержит и радиацию, вирус мутирует. И большинство мутаций, которые возникают, вирусу на пользу не идут», — говорит Александр Гинцбург.

Источник

«ЭпиВакКорона»: что мы знаем и чего не знаем

С декабря 2020 года вне рамок клинических испытаний началась вакцинация «ЭпиВакКороной» — препаратом, разработанным предприятием ГНЦ «Вектор» [1], — а в феврале планируется массовая вакцинация [2]. Сообщается, что у препарата 100-процентная иммунологическая эффективность [3]. Что это значит? Независимым экспертам или врачам про эту вакцину известно мало. Научных публикаций нет никаких. Вместо заявленной 100-процентной эффективности мы пока что имеем большую научную непрозрачность.

Итак, по порядку: что мы все-таки знаем? Роспотребнадзор сообщает [4]: «Вакцина представляет собой химически синтезированные пептидные антигены трех фрагментов S-белка вируса SARS-CoV-2, конъюгированные с белком-носителем и адсорбированные на алюминий-содержащем адъюванте».

S-белок — это шиповидный белок, он же спайк (spike-protein; в разных текстах его называют по-разному). Пептид — это фрагмент белка. В существующем патенте [5] описано семь пептидов шиповидного белка и несколько возможных белков-носителей. В интервью для СМИ разработчики сообщают, что в качестве носителя в вакцинной разработке используется вирусный нуклеокапсидный белок, продукт экспрессии в кишечной палочке [6]. Полный список пептидов шиповидного белка, их координаты, а также названия доменов и субъединиц, в которых они находятся, приведен в таблице ниже.

Пептиды шиповидного белка, представленные в патенте [5]

Какие три пептида из списка вошли в разработку «ЭпиВакКороны», неизвестно. Как сообщают РИА Новости, цитируя разработчиков, «вакцинные пептиды содержат прежде всего В-клеточные эпитопы, основным источником Т-клеточных эпитопов служит нуклеокапсидный белок» [6].

Что это значит? Попробуем разобраться. Прежде всего стоит объяснить, что эпитоп (он же антигенная детерминанта) — это часть макромолекулы (в нашем случае — вирусного белка или белка из вакцинного материала), которая распознаётся иммунными клетками. То есть это как раз то, что видит иммунная система, и то, что ей помогает понять, какие «приметы» можно различить у «чужеродного агента» (вируса). Не все части макромолекулы «видны» иммунной системе — к каким-то частям макромолекул она «слепа». С этим связана трудность создания пептидных вакцин: пептиды, используемые в качестве антигенных детерминант, не должны располагаться в областях вирусного белка, невидимых иммунному надзору.

Рис. 1. Схема вирусной частицы и вирусных антигенов, которые находятся в «ЭпиВакКороне». В образе трех драконов представлен тример шиповидного белка; только этот белок торчит наружу из вирусной частицы в такой степени, что с ним могут взаимодействовать антитела, которые «цепляют» вирус. Все остальные белки находятся или внутри, полностью под липидной оболочкой вириона, или частично интегрированы в нее. Антитела на эти, другие белки все-таки образуются у переболевших ковидом, но не обладают защитными функциями

Вирус SARS-CoV-2 устроен так, что нейтрализовать его могут только антитела к шиповидному белку. Антитела к нуклеокапсидному белку этого сделать не могут: этот белок находится внутри вирусной частицы, и антитела не могут с ним провзаимодействовать [7]; следовательно, он недоступен для антител в интактном вирусе. Тем не менее нуклеокапсидный белок в качестве антигена (чужеродного вещества) может помочь иммунному ответу (см. ниже). Рис. 1 схематично показывает состав вакцины «ЭпиВакКорона».

Таким образом, первостепенная задача пептидов шиповидного белка из вакцины «ЭпиВакКорона» — стимулировать выработку антител, способных опознать вирус и не дать ему заразить клетку; то есть в пептидах должны находиться видимые для иммунной системы «приметы врага» (вируса) — вирусные антигенные детерминанты. Другие разработчики вакцин решают эту проблему, используя полноразмерный шиповидный белок как антиген: в нем гораздо больше антигенных детерминант [8].

Многочисленные экспериментальные работы [9, 10, 11, 12] показывают, что только небольшая часть пептидов из вирусного шиповидного белка «видна» иммунной системе человека и может вызывать образование нейтрализующих антител. Эти области белка тщательно откартированы.

В интервью СМИ разработчики сообщают, что пептиды «ЭпиВакКороны» содержат В-клеточные эпитопы [6, 13]. Однако вышеописанные работы показывают, что шесть пептидов, описанных в патенте, расположены во фрагментах шиповидного белка, которые практически невидимы для иммунной системы человека, не могут являться В-клеточными эпитопами и не могут провоцировать производство нейтрализующих антител.

Поэтому к разработчикам вакцины возникают следующие вопросы: у какого процента людей каждый конкретный пептид из вакцины «Вектора» вызывает производство не просто антител, а именно нейтрализующих антител? У какого процента волонтеров, участников первой и второй фаз испытаний, возникают нейтрализующие антитела к каждому конкретному пептиду или хотя бы к одному из набора? Все ли пептиды из трех способны провоцировать выработку нейтрализующих антител? Проводились ли такие исследования по индивидуальным пептидам у людей, а не у кроликов? Нет ли среди трех пептидов, выбранных для производства вакцины, таких, которые представляют собой балласт и не работают ни у одного человека?

Согласно данным экспериментов, описанным в патенте [5], иммуногенность каждого отдельного пептида проверялась при иммунизации кроликов конъюгатом индивидуального пептида с белком-носителем. Однако в настоящий момент уже показано, что то, что в вирусном шиповидном белке лучше видно иммунной системе кролика [14], почти не видно иммунной системе человека [9, 10, 11, 12].

На вирусные белки в организме человека вырабатывается масса разных антител, однако лишь небольшая их часть способна нейтрализовать вирус. В то же время некоторые ненейтрализующие антитела всё же полезны в борьбе с инфекцией. Есть разные механизмы их вовлечения в процесс элиминации как вирусов, так и зараженных ими клеток из организма. Тем не менее именно способность вакцины вызывать производство нейтрализующих антител часто используется как первый (хотя и грубый) критерий оценки ее эффективности. Поэтому хотелось бы знать, каковы титры антител на шиповидный белок у добровольцев — участников клинических испытаний. Пока что эти участники жалуются на отсутствие или на очень маленький титр выявляемых антител (см. ниже).

Стоит заметить, что у вируса SARS-CoV-2, как и у многих других вирусов, есть способ защиты от антител — он заключается в использовании гликанового щита, т. е. молекул полисахаридов, присоединенных к шиповидному белку. Такое присоединение называется гликозилированием: антителам трудно подобраться к участкам белка с присоединенными полисахаридами — их просто не пускает гликановый щит. Хочется заметить, что три пептида из описанных в патенте попадают в «опасную зону» гликозилирования [15]. Так, в белке гликозилируется 165-я аминокислота, а пептид ID NO: 2 начинается со 166-й аминокислоты — это рядом! Кроме того, в шиповидном белке гликозилируется 1194-я аминокислота, которая находится прямо в середине пептидов ID NO: 6 и ID NO: 7. Иными словами, даже если пептиды ID NO: 2, ID NO: 6, ID NO: 7 и спровоцируют выработку антител, то эти антитела, скорее всего, «упрутся» в гликановый щит, при этом они вряд ли смогут нейтрализовать вирус или причинить ему вред другим путем.

Кроме пептидов шиповидного белка, в «ЭпиВакКорону» входит химера вирусного нуклеокапсидного и бактериального белка, связывающего сахар мальтозу. По замыслу разработчиков такой химерный белок должен провоцировать Т-клеточный ответ. Действительно, из литературы [16] известно, что вирусный нуклеокапсидный белок способен стимулировать образование Т-лимфоцитов, распознающих в нем многие эпитопы.

Разработчики заявляют: «Через 5–6 недель после вакцинации у большей части добровольцев, привитых вакциной. наблюдалась индукция выраженного специфического Т-клеточного иммунного ответа, что было обнаружено при анализе клеток крови добровольцев при стимуляции вирусными антигенами в экспериментах ex vivo». Будем надеяться, что разработчики не ограничатся заявлениями, а опубликуют соответствующие наблюдения.

Теперь посмотрим, что происходит с преклиническими и клиническими исследованиями. Краткая схема, суммирующая информацию о сроках проведения этих исследований, показана на рис. 2.

Увы, тут можно только посетовать: вакцина уже введена в гражданский оборот, а публикаций нет никаких, первая и вторая фазы испытаний не закончены. В настоящее время идет третья фаза испытаний, планируется участие трех тысяч человек. При этом трудно представить, как на такой небольшой выборке можно будет оценить протективность вакцины, а именно разницу в заболеваемости между теми, кто получил прививку, и теми, кто получил плацебо.

Увы, маленький размер группы добровольцев — это только одна из проблем третьей фазы испытаний «ЭпиВакКороны». Есть и другие. Добровольцы — участники испытаний объединились в группу [17] и написали коллективное открытое письмо, адресованное Минздраву, Роспотребнадзору и другим ведомствам [18]. Я цитирую:

«Мы самостоятельно и за свой счет проверяем у себя уровень антител, однако все полученные результаты ниже референсного значения. „Вектор“ утверждает, что определить нужные антитела можно только их тест-системой, но держит ее в тайне. В такой ситуации возникают сомнения в эффективности вакцины у многих участников исследования и у тех, кто уже успел получить вакцину в рамках гражданской вакцинации. 33% от числа документально подтвердивших свое участие в исследовании сдали такие тесты, и у всех получены отрицательные анализы на антитела (против коронавируса)».

На это письмо уже был получен ответ [19], в котором к использованию рекомендуются тест-системы для иммуноферментного выявления антител к белкам коронавируса SARS-CoV-2 [20]. В письме также говорится: «. проведение. клинических исследований в условиях получения рядом вакцинных препаратов разрешения на применение в Российской Федерации в рамках гражданского оборота создает сложную этическую и научную проблему продолжения контролируемых слепых рандомизированных исследований».

С вышеизложенными утверждениями в ответе Роспотребнадзора трудно не согласиться. У «ЭпиВакКороны» на пути к тому, чтобы стать высококачественным препаратом, хорошо защищающим от вирусной инфекции и вызывающим доверие у специалистов, много серьезных препятствий и проблем, требующих нетривиальных решений. Всё же хотелось бы надеяться, что соответствующая вакцинная разработка станет прозрачнее для общественной и научной экспертизы, а разработчикам удастся в ближайшее время не только опубликовать результаты своих наработок, но и найти надежный способ оценки протективной эффективности этой вакцины против COVID-19 у людей.

Благодарность
Автор выражает глубокую благодарность кандидатам биологических наук Елене Кудрявцевой и Алексею Вольфсону за внимательное прочтение текста и конструктивную критику.

Источник

Троица COVID-19: иммунитет, воспаление и вторжение

Аннотация

Коронавирус-2 (SARS-CoV-2), сопряженный с тяжелым острым респираторным синдромом, является возбудителем текущей пандемии коронавирусной болезни 2019 года (COVID-19). Наряду с исследованиями вирусологии SARS-CoV-2, понимание фундаментальных физиологических и иммунологических процессов, лежащих в основе клинических проявлений COVID-19, жизненно важно для идентификации вируса и рационального дизайна эффективных методов лечения. В данном обзоре будет рассмотрена патофизиология инфекции SARS-CoV-2. Мы описываем взаимодействие SARS-CoV-2 с иммунной системой и последующий вклад дисфункциональных иммунных реакций в прогрессирование заболевания. Помимо анализа сообщений, описывающих течение SARS-CoV-2, мы делаем выводы на основе патофизиологических и иммунологических особенностей других коронавирусов человека, преимущественно поражающих нижние дыхательные пути, вызывающих тяжелый острый респираторный синдром (SARS-CoV) и ближневосточный респираторный синдром (MERS-COV).

Таким образом, существует неотложная необходимость в лучшем понимании биологии взаимодействия хозяин-патоген при COVID-19, поскольку это даст важную информацию для определения тактики ведения заболевших, включая установление новых методов лечения. Здесь мы рассмотрим литературу по патофизиологии SARS-CoV-2, его взаимодействию с клетками-мишенями и иммунному ответу на вирус, включая вклад дисфункционального иммунного ответа в прогрессирование заболевания. В частности, мы подчеркиваем значение специфических особенностей инфекции для разработки многообещающих методов лечения, которые могут быть направлены на вирус или дисфункциональный иммунный ответ. Кроме того, исследования, посвященные адаптивному иммунному ответу, будут иметь решающее значение для разработки вакцин и препаратов моноклональных антител.

Патогенез COVID-19

Известно, что коронавирусы вызывают заболевания у людей и животных. Четыре из них (человеческие коронавирусы 229E, NL63, OC43 и HKU1) обычно поражают только верхние дыхательные пути и вызывают относительно легкие симптомы [2]. Однако существует три коронавируса (коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-CoV), коронавирус ближневосточного респираторного синдрома (MERS-CoV) и SARS-CoV-2, которые могут реплицироваться в нижних дыхательных путях и вызывать пневмонию с вероятностью смертельного исхода. SARS-CoV-2 относится к роду бета-коронавирусов. Его ближайший родственник среди коронавирусов человека — SARS-CoV, с 79 % генетического сходства [3]. Однако среди всех известных генетических последовательностей коронавирусов SARS-CoV-2 наиболее похож на коронавирус летучей мыши RaTG13 со сходством 98 % [4]. Также высокое сходство наблюдается с геномом коронавируса панголина (чешуйчатый муравьед) [5].

Как и другие респираторные коронавирусы, SARS-CoV-2 передается в основном воздушно-капельным путем, также возможен, но не доказан фекально-оральный путь передачи. Средний инкубационный период инфекции составляет приблизительно 4–5 дней до появления симптомов [6–9], у 97,5 % пациентов симптомы развиваются в течение 11,5 дней [8]. На момент госпитализации у пациентов с COVID-19 обычно наблюдается лихорадка и сухой кашель; реже пациенты также испытывают затрудненное дыхание, боли в мышцах и/или суставах, головную боль, головокружение, диарею, тошноту и кровохарканье [6, 10–15]. В течение 5–6 дней после появления симптомов вирусная нагрузка SARS-CoV-2 достигает своего пика, что значительно раньше, чем у схожего SARS-CoV, при котором вирусная нагрузка достигает пика примерно через 10 дней после появления первых симптомов [16–19]. Тяжелые случаи COVID-19 прогрессируют до острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС) в среднем за 8–9 дней от начала заболевания [11, 20].

Патофизиология развития инфекции SARS-CoV-2 очень похожа на таковую при заражении SARS-CoV: агрессивная воспалительная реакция с вовлечением дыхательных путей [21]. Следовательно, тяжесть заболевания у пациентов обусловлена ​​не только вирусной инфекцией, но и реакцией организма хозяина. Корреляция степени тяжести с возрастом также, в целом, соответствует эпидемиологии SARS-CoV и MERS-CoV [6, 11, 14].

ОРДС, наблюдаемый при тяжелом течении COVID-19, характеризуется затрудненным дыханием и низким уровнем кислорода в крови [22]. В результате у некоторых пациентов могут развиться вторичные бактериальные и грибковые инфекции [14]. ОРДС может привести к дыхательной недостаточности, которая является причиной смерти в 70 % случаев летальных исходов COVID-19 [22]. Кроме того, мощный выброс цитокинов иммунной системой в ответ на вирусную инфекцию и/или вторичные инфекции могут привести к цитокиновому шторму и симптомам сепсиса, который является причиной смерти в 28 % летальных случаев COVID-19 [22], вследствие неконтролируемого воспаления, приводящего к полиорганной недостаточности, особенно поражая сердечную, печеночную и почечную системы (рис. 1). Большинство пациентов с SARS-CoV инфекцией, у которых развивалась почечная недостаточность, в конечном итоге умирали [23].

Инфицирование клетки-хозяина и его предупреждение

Первым этапом заражения является связывание вируса с клеткой-хозяином через рецептор-мишень. Ранее проведенная работа над исследованием SARS-CoV показала, что этот вирус главным образом нацелен на эпителиальные клетки дыхательных путей, альвеолярные эпителиальные клетки, эндотелиальные клетки сосудов и альвеолярные макрофаги, которые имеют на своей поверхности рецептор ангиотензин-превращающего фермента 2 (АПФ2), используемый SARS-CoV в качестве рецептора-мишени [24 –26] (рис. 2). Поскольку SARS-CoV-2 использует тот же рецептор проникновения, эти клетки, вероятно, являются также мишенью и для него [4, 27, 28]. Инфицирование SARS-CoV снижает экспрессию АПФ2 в клетках легких. Поскольку потеря функции АПФ2 в легких связана с острым повреждением легких, вызванное вирусом подавление АПФ2 может играть важную роль в патофизиологии заболевания [29–32]. Как было доказано, АПФ2 регулирует ренин-ангиотензиновую систему (РАС) [32]. Следовательно, снижение функции АПФ2 после инфицирования вирусом может привести к дисфункции РАС, оказывающей влияние на кровяное давление и водно-электролитный баланс, а также увеличивающей воспаление и проницаемость сосудов в дыхательных путях.

При COVID-19 наблюдается разница в уровне летальности между мужчинами (2,8 %) и женщинами (1,7 %) [33]. Поскольку АПФ2 расположен на Х-хромосоме, могут присутствовать аллели, которые придают устойчивость к COVID-19, что объясняет более низкую летальность среди женщин. Кроме того, половые гормоны эстроген и тестостерон имеют различные иммунорегуляторные функции, которые могут влиять на иммунную защиту и, следовательно, тяжесть заболевания [34].

SARS-CoV-2 имеет 79 % совпадения последовательности генома с SARS-CoV [4]. Шиповидный белок экспрессируется на поверхности вирусных частиц, придавая им характерный «коронованный» вид. Шиповидный белок состоит из двух субъединиц: S1 и S2. Субъединица S1 состоит из амино-терминального домена и рецептор-связывающего домена (RBD), который в SARS-CoV простирается от аминокислотного остатка 318 до аминокислотного остатка 510 [35–37]. RBD связывается с АПФ-2 клетки-хозяина как с рецептором-мишенью, запуская тем самым процесс инфицирования [4]. Связывание RBD с АПФ-2 запускает эндоцитоз вириона SARS-CoV-2 и подвергает его воздействию эндосомных протеаз [38]. Субъединица S2 состоит из области пептида слияния (FP) и двух областей гептадных повторов: HR1 и HR2 [39, 40]. Внутри эндосомы субъединица S1 отщепляется, обнажая пептид слияния, который внедряется в мембрану клетки-хозяина. Затем область S2 складывается сама для объединения областей HR1 и HR2. Это приводит к слиянию мембран и высвобождает вирусное содержимое в цитоплазму хозяина.

Существует 72 % сходства в аминокислотной последовательности RBD SARS-CoV и SARS-CoV-2, также у них очень похожи третичные структуры. Вычислительное моделирование и биофизические измерения показывают, что аффинность RBD SARS-CoV-2 к АПФ2 более высокая, чем у SARS-CoV [41, 42]. Кроме того, шиповидный белок SARS-CoV-2 содержит фурин-подобный сайт расщепления (аналогично MERS-CoV и человеческому коронавирусу OC43), который не обнаружен у SARS-CoV [43]. Эти характеристики могут способствовать повышенной контагиозности SARS-CoV-2 по сравнению с SARS-CoV. В дополнение к предварительному расщеплению фурином, для правильной обработки шиповидного белка SARS-CoV-2 и облегчения проникновения в клетку-хозяина также необходима клеточная сериновая протеаза TMPRSS2 [44].

Одним из путей разработки терапевтических средств против SARS-CoV-2 является блокирование целевого рецептора АПФ2 хозяина или TMPRSS2 (рис. 3). В настоящее время существуют соединения, нацеленные на эти молекулы, которые были одобрены для лечения других заболеваний. Например, алгоритмы нейросетей предсказывают, что барицитиниб, ингибитор янус-киназы (JAK), одобренный для лечения ревматоидного артрита, может ингибировать опосредованный АПФ2 эндоцитоз [45]. Другой ингибитор JAK, руксолитиниб, будет опробован в клинических испытаниях для лечения COVID-19 в конце этого года [46]. Альтернативная стратегия заключается в доставке высоких концентраций растворимой формы АПФ2, что потенциально может снизить проникновение вируса в клетки-мишени. Этот принцип тестируется с APN01, рекомбинантной формой АПФ2, разработанной APEIRON, которая в настоящее время проходит клинические испытания [47]. Моноклональные антитела к шиповидным белкам также могут ингибировать проникновение вируса в клетку и дополнительно обсуждаются в разделе «В-клеточный иммунитет».

Нафамостат мезилат [48, 49] и камостат мезилат [44] являются известными ингибиторами фермента TMPRSS2 и в настоящее время одобрены в нескольких странах для лечения других заболеваний. Хотя на момент написания статьи не проводилось никаких клинических испытаний, специально тестирующих эти препараты против COVID-19, когда мезилат камостата был протестирован на вирусе SARS-CoV-2, выделенном от пациента, он предотвращал проникновение вируса в клетки легкого [44, 50]. Если этот подход покажет свою эффективность, быстрое перепрофилирование таких препаратов будет рабочей и своевременной мерой в борьбе с COVID-19.

Воспалительный иммунопатогенез

Инфекция SARS-CoV-2 и разрушение клеток легких запускают местный иммунный ответ с привлечением макрофагов и моноцитов, которые отвечают на инфекцию, высвобождают цитокины и первичные адаптивные иммунные ответы T- и B-клеток. В большинстве случаев этот процесс способен привести к разрешению инфекции. Однако в некоторых случаях возникает дисфункциональный иммунный ответ, который может вызвать тяжелую легочную или даже системную патологию.

Цитопатические вирусы, включая SARS-CoV-2 [51], вызывают повреждение или гибель инфицированных вирусом клеток и тканей в ходе репликативного цикла вируса. Репликация вируса в эпителиальных клетках дыхательных путей [52] может вызывать высокий уровень связанного с вирусом пироптоза с ассоциированной повышеной проницаемостью сосудов, как это наблюдается у пациентов с SARS-CoV [53]. Пироптоз является воспалительной формой запрограммированной гибели клеток, которая обычно наблюдается при цитопатической вирусной инфекции [54]. Это вероятный триггер для последующего воспалительного ответа [55]. Во время инфекции SARS-CoV-2 повышается уровень IL-1β, важного цитокина, высвобождаемого во время пироптоза [11]. Используя различные паттерн-распознающие рецепторы (PRR), альвеолярные эпителиальные клетки и альвеолярные макрофаги обнаруживают высвобожденные патоген-ассоциированные молекулярные структуры (PAMP), такие как вирусная РНК, и связанные с повреждением молекулярные структуры (DAMP), включая АТФ, ДНК и ASC олигомеры. Возникает волна локального воспаления, стимулирующая повышенную секрецию провоспалительных цитокинов и хемокинов IL-6, IFNγ, MCP1 и IP-10 в кровь [11, 22]. Эти цитокины являются индикаторами поляризованного ответа T-хелперов 1 типа (Тх1), что аналогично наблюдениям, проведенным для SARS-CoV и MERS-CoV [56]. Секреция таких цитокинов и хемокинов привлекает иммунные клетки, в частности моноциты и Т-лимфоциты, но не нейтрофилы, из крови в очаг инфекции [57, 58]. Рекрутирование иммунных клеток из кровотока в легкие и инфильтрация дыхательных путей лимфоцитами может объяснить лимфопению и увеличение соотношения нейтрофилов и лимфоцитов, наблюдаемого примерно у 80 % пациентов с инфекцией SARS-CoV-2 [6, 59].

У большинства людей рекрутированные клетки элиминируют инфекцию в легких, иммунный ответ уменьшается, и пациенты выздоравливают. Однако у некоторых пациентов возникает дисфункциональный иммунный ответ, который запускает цитокиновый шторм, опосредованно вызывающий выраженное воспаление в ткани легких. Было отмечено, что у пациентов с тяжелой формой COVID-19, нуждающихся в интенсивной терапии в больницах, наблюдались более высокие уровни IL-2, IL-7, IL-10, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF), IP-10, MCP1, макрофагального воспалительного белка 1α (MIP1α) и фактора некроза опухоли (ФНО) в плазме крови [11]. Уровни IL-6 у этих пациентов продолжали увеличиваться с течением времени и являлись относительно более высокими у погибших, чем у выживших [60].

Примечательно, что в жидкости бронхоальвеолярного лаважа у пациентов с тяжелым течением COVID-19 определяется обширная воспалительная моноцитарная популяция макрофагов FCN1+ [61]. Кроме того, у пациентов с тяжелым заболеванием значительно выше процент воспалительных моноцитов CD14+ и CD16+ в периферической крови, чем у пациентов с легким течением болезни [62]. Эти клетки секретируют воспалительные цитокины, включая MCP1, IP-10 и MIP1α, которые способствуют развитию цитокинового шторма (рис. 1).

Механизмы, с помощью которых SARS-CoV-2 подрывает врожденные функции противовирусных цитокинов, еще предстоит изучить, но исследование SARS-CoV показывает, что множественные структурные и неструктурные белки вируса противодействуют интерфероновому ответу. Антагонизм возникает на различных этапах передачи сигналов интерферона, в том числе путем предотвращения распознавания паттерн-распознающим рецептором (PRR) вирусной РНК 63, путем предотвращения передачи сигналов PRR через TBK1 / ингибитор субъединицы ε киназы транскрипционного фактора NF-κB (каппа-би) (IKKε), TRAF3 и IRF3 [63, 66], предотвращая передачу сигналов интерферона далее через STAT1 [67] и способствуя деградации мРНК хозяина, ингибируя трансляцию белка [68]. Весьма вероятно, что по крайней мере некоторые из этих механизмов аналогичны и для SARS-CoV-2. Антагонизм белков вируса по отношению к интерфероновому ответу способствует репликации вируса, что приводит к увеличению высвобождения продуктов пироптоза, которые могут дополнительно вызывать аберрантные воспалительные реакции.

Неограниченная воспалительная инфильтрация клеток сама по себе может привести к повреждению легких через чрезмерную секрецию протеаз и активных форм кислорода в дополнение к прямому повреждению, вызванному вирусом. Вместе они приводят к диффузному альвеолярному повреждению, включая десквамацию альвеолярных клеток, образование гиалиновых мембран и отек легких [57, 58]. Это ограничивает эффективность газообмена в легких, вызывая затруднение дыхания и приводя к снижению уровня кислорода в крови. Легкие также становятся более уязвимыми для вторичных инфекций.

Вдобавок к локальному повреждению, цитокиновый шторм производит волновые эффекты по всему телу. Повышенные уровни цитокинов, таких как ФНО, могут вызывать септический шок и полиорганную недостаточность. Это может привести к повреждению миокарда и нарушению кровообращения, наблюдаемым у некоторых пациентов [69]. Пожилые пациенты (в возрасте старше 60 лет) и люди с сопутствующими заболеваниями более склонны к развитию такого дисфункционального иммунного ответа, который способствует развитию патологии, а также не позволяет уничтожить возбудителя. Точные причины этого неясны, хотя одной из причин может быть старение микросреды легких, вызывающее измененное созревание дендритных клеток, миграцию в лимфоидные органы [70] и, следовательно, дефектную активацию Т-клеток. Напротив, дети, как правило, не склонны к развитию тяжелой формы заболевания, несмотря на то, что у них могут наблюдаться высокие вирусные титры [71]. Во всех возрастных группах моложе 18 лет более 50 % детей испытывали легкие симптомы или не имели симптомов вовсе, у менее чем 6 % детей развивались тяжелые симптомы [72]. Таким образом, в то время как вышеупомянутые исследования описывают важные достижения, полная картина критических иммунных факторов, которые лежат в основе развития более тяжелых воспалительных реакций у некоторых пациентов, неясна.

Вопрос о том, необходимо ли сохранение вируса для нанесения постоянного ущерба, остается спорным. Пик вирусных титров в образцах клеток дыхательных путей при инфекциях SARS-CoV и SARS-CoV-2 может наблюдаться еще до появления симптомов пневмонии [17, 19]. Тем не менее большое ретроспективное когортное исследование показало, что вирусная РНК обнаруживалась у не выживших пациентов вплоть до момента смерти, что позволяет предположить корреляцию между устойчивостью вируса и неблагоприятным исходом заболевания [60]. Поскольку вирусная РНК может задерживаться даже после активной инфекции и не является показателем инфекционности вируса, вопрос о том, связан ли исход с количеством инфекционных частиц, дискуссионен. Кроме того, более ранние исследования SARS-CoV показали, что вирус, кроме клеток легких, может инфицировать и другие мишени. Примечательно, что вирус был обнаружен в Т-лимфоцитах [73], макрофагах [74–76] и дендритных клетках, происходящих из моноцитов [77]. Непосредственное уничтожение вируса лимфоцитами может способствовать возникновению лимфопении, наблюдаемой у пациентов [73]. Вирусная инфекция в иммунных клетках, таких как моноциты и макрофаги, может привести к аберрантной выработке цитокинов, даже если вирус активно не размножается [74–77]. Степень тропности SARS-CoV-2 к этим клеткам остается неясной. Понимание точных причин иммунной дисфункции имеет решающее значение для применения соответствующих иммуномодулирующих методов лечения.

Несколько иммуносупрессивных методик лечения, направленных на ограничение иммуноопосредованого повреждения при COVID-19, находятся на различных этапах разработки и перечислены в таблице 1. В настоящее время проводятся испытания кортикостероидов для лечения COVID-19 [78], хотя этот класс препаратов не рекомендовался во время эпидемии SARS-CoV 2003 г. [79, 80]. Кроме того, проводятся клинические испытания антагониста IL-6 тоцилизумаба для проверки его эффективности [81], а также исследуется сарилумаб [82]. В других клинических испытаниях тестируются эффекты воздействия на колониестимулирующий фактор гранулоцитов и макрофагов (GM-CSF), например, с помощью гимсилумаба [83], лензилумаба [84] и намилумаба [85]. Еще одним новым методом вспомогательной терапии является цитосорб [86], который поглощает разнообразные цитокины, DAMP и PAMPs с целью снижения их уровня в крови и смягчения иммунопатологических процессов.

Талидомид, препарат с иммуномодулирующими свойствами, также был успешно применен у одного пациента с COVID-19 [87]. В результате на сегодняшний день было начато два клинических испытания, чтобы проверить его потенциал для уменьшения повреждения легких [88, 89]. В контексте инфекции SARS-CoV предлагался, но не был проверен антагонист ФНО, впрочем он также не был проверен на пациентах с COVID-19 [90]. Небольшое открытое нерандомизированное исследование показало, что комбинация гидроксихлорохина (известного противомалярийного средства) и азитромицина (распространенного антибиотика) может оказаться эффективной для лечения пациентов с тяжелой формой COVID-19 [91]. Хотя влияние гидроксихлорохина на прямое ингибирование вируса [92] и его противовоспалительная и иммуномодулирующая активность известны [93], еще предстоит определить, действуют ли эти механизмы в отношении COVID-19 [94].

Т-клеточный иммунитет

Т-клеточный и В-клеточный иммунный ответ на SARS-CoV-2 реализуется примерно через 1 неделю после появления симптомов COVID-19. CD8+ T-клетки важны для прямой атаки и уничтожения инфицированных вирусом клеток, тогда как CD4+ T-клетки имеют решающее значение для активации как CD8+ T-клеток, так и B-клеток. CD4+ T-клетки также ответственны за выработку цитокинов, которые управляют рекрутментом иммунных клеток. Первое вскрытие пациента с COVID-19 выявило накопление мононуклеарных клеток (вероятно, моноцитов и Т-клеток) в легких в сочетании с низким уровнем гиперактивных Т-клеток в периферической крови [57]. Наряду с сообщениями о лимфопении и снижении уровня периферических Т-клеток у пациентов [6, 95–97], эти данные свидетельствуют о том, что Т-клетки привлекаются из кровотока в очаг инфекции для контроля вирусной инфекции. У пациентов с COVID-19 интенсивное истощение Т-клеток и снижение функционального разнообразия указывали на развитие тяжелого течения болезни [98]. Несмотря на ослабленный ответ у пациентов, которые выздоровели от инфекции SARS-CoV, развились специфические для коронавируса Т-клетки памяти, которые были обнаружены через 2 года после выздоровления [99, 100].

SARS-CoV-специфичные CD4+ T-клетки экспрессируют IFNγ, ФНО и IL-2, что позволяет предположить, что у пациентов с инфекцией SARS-CoV проявляется Тх1-клеточный ответ, и для контроля инфекции используется в основном клеточный иммунитет [101, 102]. Хотя такой провоспалительный профиль может быть фактором, ухудшающим иммунопатогенез, было предположено что T-клетки CD4+ угнетают SARS, поскольку истощение пула этих клеток у мышей приводило к более медленной элиминации вируса из клетки хозяина и более выраженному воспалению легких [103]. При использовании адаптированного для мышей штамма SARS-CoV иммунизация дендритными клетками, несущими пептиды SARS-CoV, привела к увеличению числа вирус-специфических CD4+ и CD8+ T-клеток, которые накапливались в легких и способствовали увеличению выживаемости [104, 105]. Кроме того, введение SARS-CoV-специфических CD4+ и CD8+ T-клеток иммунодефицитным мышам приводило к улучшению защиты против адаптированного для мышей штамма SARS-CoV [105].

Несмотря на доказательства важной роли Т-клеток в борьбе с инфекцией, несколько вакцин против SARS-CoV, ранее протестированных на животных моделях, выявили признаки иммунопатологии, связанной с Тх2-опосредованной эозинофильной инфильтрацией [106,107]. В частности, у старых мышей, которые были вакцинированы, наблюдалось скорее усугубление иммунной патологии, а не защита [108]. Дальнейшее изучение природы защитного и дисфункционального Т-клеточного ответа необходимо для определения оптимальных стратегий использования Т-клеток в разработке вакцин [109]. Коронавирус-специфические Т-клетки, несомненно, важны для устранения вируса и контроля развития заболевания и должны учитываться в стратегиях вакцинации. Однако вопрос о том, способен ли Т-клеточный иммунный ответ предотвращать инфекцию у людей, еще предстоит прояснить. Эти знания будут важны для разработки вакцин.

В-клеточный (гуморальный) иммунитет

B-клеточный иммунный ответ у пациентов с COVID-19 возникает одновременно с реакцией T-хелперных фолликулярных клеток примерно через 1 неделю после появления симптомов [110]. У пациентов с инфекцией SARS-CoV B-клеточный ответ обычно возникает в первую очередь против белка нуклеокапсида (N). В течение 4–8 дней после появления первых симптомов обнаруживается повышение титра антител к шиповидным белкам [111, 112]. Нейтрализующие антитела к шиповидным белкам начинают вырабатываться ко 2 неделе заболевания, а у большинства пациентов нейтрализующие антитела вырабатываются к 3 неделе [113, 114]. Учитывая, что вирусная нагрузка достигает пика для SARS-CoV-2 раньше, чем для SARS-CoV [16–19], выработка антител также может начинаться раньше. Похоже, что у некоторой части пациентов долгосрочные антитела к SARS-CoV-2 могут не вырабатываться [115]. Остается неизвестным, подвержены ли эти пациенты повторному заражению, о котором есть отдельные сообщения [116, 117].

Вероятно, против SARS-CoV-2 будут эффективны антитела: образцы реконвалесцентной плазмы были применены в отношении COVID-19 с хорошими клиническими результатами [118], также они ранее успешно использовались при лечении ОРДС [119–121].

Хотя механистические корреляты защиты у людей еще не идентифицированы, считается, что нейтрализация вируса является одной из важных функций антител, хотя конкретный титр и специфичность требуемого для защиты набора антител остаются неопределенными. В SARS-CoV основной мишенью нейтрализующих антител является RBD [122], содержащий 193 аминокислотных остатка (аминокислоты 318–510) в шиповидном белке, которые могут независимо связываться с рецептором АПФ2 — мишенью клетки-хозяина [35–37]. Хотя некоторые из ранее идентифицированных моноклональных антител к SARS-CoV также связываются и с SARS-CoV-2 [123], большинство все же не делают этого [124], что может быть связано со значительными различиями в RBD SARS-CoV-2 и SARS-CoV (рис. 4). В частности, из 33 аминокислот в регионе 460–492 аминокислоты шиповидного белка SARS-CoV, содержащего ключевые остатки, связывающиеся с АПФ2 [125], менее половины (15/33) сохраняются в SARS-CoV-2. Тем не менее мышиная антисыворотка против белка SARS-CoV может перекрестно нейтрализовать псевдовирус SARS-CoV-2, что указывает на перекрывающиеся нейтрализующие эпитопы между двумя вирусами [28, 126].

В Китае больницы начали использовать плазму реконвалесцентов в качестве источника поликлональных антител для лечения COVID-19, и ранние данные свидетельствуют о положительном влиянии в виде снижения вирусной нагрузки и смертности [127, 128]. В настоящее время предпринимаются усилия для разработки терапевтических моноклональных антител против SARS-CoV-2 с использованием таких подходов, как отображение фаговой библиотеки, традиционная иммунизация мыши и создание гибридомы, а также клонирование B-клеточных последовательностей людей-реконвалесцентов [129–132]. SARS-CoV, по-видимому, не имеет механизмов для предотвращения нейтрализации антителами, таких как экранирование гликаном сайта связывания рецептора антителом [133]. Это дополнительно подтверждается тем фактом, что организм пациентов с инфекцией SARS-CoV, как правило, был способен вырабатывать нейтрализующие антитела. Фрагмент рекомбинантного шиповидного белка, который включал в себя RBD SARS-CoV, показал самую высокую иммунногенность по сравнению с другими протестированными фрагментами рекомбинантного шиповидного белка, что позволяет предположить, что иммунная система способна эффективно нацеливаться на нейтрализующие эпитопы [134]. Таким образом, если SARS-CoV-2 ведет себя так же, как и SARS-CoV в этом отношении, вполне вероятно, что усилия по разработке нейтрализующих моноклональных антител будут оправданы.

Возможно, изменения в шиповидном белке сделают SARS-CoV-2 устойчивым к некоторым моноклональным антителам, особенно когда он мутирует. На данный момент весь RBD остается неизменным, и существует только четыре известных редких несинонимических изменения в шиповидном белке: V483A, L455I, F456V и G476S135. Изменение V483A сопоставляется с аналогичным естественным изменением, обнаруженным в MERS-CoV, I529T, где оно снижает связывание вирусного белка с рецептором-мишенью хозяина, а также повышает устойчивость к нейтрализации антителами из образцов сыворотки от пациентов с MERS [136]. Изменения F456V и G476S также соответствуют сходным позициям изменения у SARS-CoV (L443R и D463G), которые были обнаружены на панели избежавших нейтрализации мутантных вирусных частиц [137].

Так или иначе выбор кандидатов для терапии антителами должен включать тщательное рассмотрение возможных нежелательных побочных эффектов. Например, ранее существующие антитела к другим коронавирусам могут обострять инфекцию SARS-CoV посредством антителозависимого усиления [138–140]. Кроме того, предыдущие исследования на животных показали, что при инфекции SARS-CoV нейтрализирующие антитела к шиповидным белкам могут потенциально усиливать тяжелое повреждение легких, усугубляя воспалительные реакции [141]. Также наблюдалась корреляция между развитием ОРДС и сероконверсией противовирусного IgG у 80 % пациентов [19]. У пациентов, организм которых выработал нейтрализирующие антитела к шиповидным белкам ранее, заболеваемость была выше; пациентам, умершим от инфекции, потребовалось в среднем всего 14,7 дня, чтобы достичь пиковых уровней активности нейтрализующих антител, в отличие от 20 дней у пациентов, которые выздоравливали [142]. Аналогично для MERS: у пациентов с более тяжелым течением заболевания титры антител, по-видимому, выше, чем у пациентов с легким заболеванием [143, 144], хотя в одном исследовании подвергается сомнению тот факт, что задержка в выработке антител связана с заболеванием [145]. Связывание иммунных комплексов антитело-вирус с активирующими Fc-рецепторами на альвеолярных макрофагах может индуцировать экспрессию провоспалительных факторов, включая IL-8 и MCP1, которые присоединяются к иммуностимулирующей среде [146]. Такие комплексы могут также активировать систему комплемента и приводить к дальнейшему нежелательному воспалению [141]. Таким образом, важно рассмотреть вопрос о разработке терапевтических антител, обладающих низкой или отсутствующей провоспалительной активностью, но сохраняющих свою способность нейтрализовать вирусы [147]. Например, могут быть внесены изменения в области Fc и/или проведено его гликозилирование, чтобы изменить аффинность связывания для активации рецепторов Fc [146, 148].

Выводы

В этом обзоре представлены различные патофизиологические механизмы инфекции SARS-CoV-2 и иммунопатогенеза COVID-19. Контроль воспалительного ответа может быть столь же важным, как таргетированное воздействие на вирус. Препараты, ингибирующие вирусную инфекцию и регулирующие дисфункциональные иммунные реакции, могут быть использованы совместно для борьбы с патологией в несколько этапов. В то же время связь между иммунной дисфункцией и тяжестью исхода заболевания у пациентов с COVID-19 должна служить предостережением при разработке и оценке вакцины. Необходимы дальнейшие исследования иммунного ответа хозяина на SARS-CoV-2, в том числе подробное изучение детерминант благоприятных и дисфункциональных исходов. Они также помогут идентифицировать биомаркеры для определения иммунных коррелятов защиты и тяжести заболевания для эффективной сортировки пациентов.

Источник