Экспрессия er pr в стромальном компоненте снижена что это значит
Определение экспрессии PR, ER, Ki67, HER-2 при раке молочной железы
Рак молочной железы – злокачественная опухоль железистой ткани молочной железы, является ведущей онкологической патологией у женщин. По данным Всемирной Организации Здравоохранения каждая восьмая женщина рискует заболеть этой патологией, независимо от возраста. Ежегодно в мире регистрируется от 800 тыс. – до 1 млн. новых случаев рака молочной железы (ВОЗ).
В настоящее время заболеваемость раком молочной железы возрастает в связи с проведением маммографического скрининга и общего старения населения (по данным European Society For Medical Oncology).
PR – рецептор к прогестерону.
ER – рецептор к эстрогену.
Ki67 – онкогенный белок.
HER-2 – Рецептор второго типа к человеческому эпидермальному фактору роста (human epidermal growth factor receptor 2).
Опухоли молочной железы являются гормонозависимыми опухолями. Эстроген и прогестерон оказывают стимулирующее действие на рост опухоли молочной железы. Белок Ki 67 является показателем пролиферативной активности опухолевых клеток. Повышенная экспрессия HER-2 характеризуется усилением пролиферации клеток, уменьшением количества рецепторов эстрогенов в опухоли, снижением эффективности химио- и гормонотерапии, таким образом, служит маркером неблагоприятного прогноза и повышенного риска рецидива заболевания.
На основании иммуногистохимического исследования (ИГХ) выделяют 4 подтипа рака молочной железы. Каждый подтип имеет свои особенности клинической картины, прогноз и тактику лечения.
Известно, что люминальные типы РМЖ имеют менее агрессивное течение и благоприятный прогноз по сравнению с HER-2 положительным и трижды негативным РМЖ. Особо обращает на себя внимание трижды негативный рак молочной железы (отрицательные РЭ, РП, HER2), который отличается агрессивным течением, ранним появлением метастазов и неблагоприятным прогнозом.
Молекулярно-биологические подтипы рака молочной железы
Определение в опухоли молочной железы экспрессии РЭ, РП, HER2 и Кi 67 является обязательным при диагностике РМЖ. Данное исследование включено в алгоритм диагностики и лечения рака молочной железы.
В заключении об исследовании должна содержаться информация не только о процентном содержании клеток, положительных по РЭ и РП, но и об интенсивности окрашивания. При сомнительном результате ИГХ исследования экспрессии HER2, рекомендуется проводить определение амплификации гена HER2 методом гибридизации in situ (FISH). (Согласно Практическим рекомендациям по лекарственному лечению инвазивного рака молочной железы, 2019 г.).
Для интерпретации результатов иммуногистохимического исследования рецепторного статуса опухоли молочной железы применяется шкала Allred, с помощью которой оценивается количество клеток, с рецепторами гормонов и интенсивность окрашивания при определении рецепторов. В данной шкале процент положительных клеток оценивается от 0 до 5 баллов, а интенсивность окрашивания от 0 до 3.
Показания к исследованию:
Определение экспрессии PR, ER, Ki67, HER-2 при раке молочной железы используется для выбора тактики назначения адъювантной терапии.
Адъювантная терапия – лекарственная терапия, которая назначается в дополнение к хирургическому и лучевому методам лечения и направлена на снижение риска рецидива болезни.
План адъювантной лекарственной терапии основывается на принадлежности опухоли к одному из молекулярно-биологических подтипов и стадии заболевания.
Иммуногистохимическая диагностика рецепторного статуса эндометрия (стадия секреции, расширенное) (PR, ER, CD56, CD138, LIF)
Описание
Иммуногистохимическая диагностика рецепторного статуса эндометрия (стадия секреции, расширенное (PR, ER, CD-56, CD-138, LIF)) — исследование биоптата ткани, меченого антителами, под микроскопом. Анализ выполняется для определения рецепторного статуса эндометрия.
ИГХ-исследования проводят после выполнения гистологического исследования.
Иммуногистохимическое исследование
Вид морфологического исследования тканей, полученных в ходе биопсии, и меченых специфическими антителами. В основе метода лежит принцип взаимодействия «антиген-антитело». Ткань, в которой происходит патологический процесс, экспрессирует антигены. При нанесении на образец ткани антител, образуется комплекс антиген-антитело. Благодаря меткам, он становится доступным для визуализации. Врач-патоморфолог изучает количество клеток, окрашенных маркёром. Он определяет в исследуемой ткани локализацию клеток, гормонов и их рецепторов, ферментов, иммуноглобулинов, компонентов клеток и отдельных генов.
Хронический эндометрит
Хронический эндометрит — это клинико-морфологический синдром, при котором возникают функциональные и структурные изменения слизистой полости матки вследствие повреждения клеток эндометрия инфекционным агентом. Хронический эндометрит может протекать без отсутствия клинических признаков. Он часто является причиной нарушения репродуктивной функции, вплоть до бесплодия.
По этиологическому фактору хронический эндометрит бывает специфическим (с выявлением инфекции) или неспецифическим (полимикробной ассоциации).
«Золотой стандарт» в диагностике хронического эндометрита это гистологическое исследование.
Диагноз выставляется врачом-патоморфологом на основании изучения биоптатов эндометрия. Морфологически заболевание проявляется инфильтрацией стромы эндометрия плазматическими клетками.
В настоящее время воспалительные заболевания органов малого таза относят к аутоиммунному процессу, который протекает как самоподдерживающаяся патологическая реакция.
Иммуногистохимическое исследование определяет характер иммунологических нарушений. Анализ выявляет пациенток с аутоиммунным воспалением и аутоиммунным ответом в эндометрии, что определяет тактику их ведения.
Рецепторы к эстрогену (ER) и прогестерону (PR)
Эстроген и прогестерон — основные женские половые гормоны. Они вырабатываются яичниками и являются основными регуляторами деятельности репродуктивной системы женщины.
Рецепторы присутствуют в различных тканях, в том числе в молочных железах и матке.
Рецепторы к эстрогену (ER) и прогестерону (PR) являются веществами белковой природы, которые локализованы на поверхности опухолевой клетки. Под влиянием женских половых гормонов, рецепторы формируют комплекс, который стимулирует появление новых опухолевых клеток. Разрушение этого механизма лежит в основе гормонотерапии.
Иммуногистохимическое определение ER и PR способно повести дифференциальную диагностику характера опухоли, выявить чувствительность опухоли к гормонам. Анализ позволяет скорректировать и уточнить лечение, а также оценить эффективность.
Опухоли с высоким содержанием рецепторов к эстрогенам и прогестерону являются высокодифференцированными. Они обладают низкой пролиферативной активностью и характеризуются не агрессивным течением. Опухоли с такими показателями хорошо отвечают на гормональную терапию и имеют хороший прогноз. Эффективность гормональной терапии составляет около 50% при опухолях, экспрессирующих рецепторы к эстрогенам, и 75% при опухолях, экспрессирующих рецепторы к обоим гормонам.
Если опухолевые клетки имеют низкое число рецепторов к эстрогенам, гормональная терапия обычно неэффективна. Исключение составляют случаи, когда опухолевые клетки экспрессируют рецепторы только к прогестерону. При таком варианте гормональная терапия эффективна у 10% таких больных.
CD-56
CD-56 — прототипный маркёр ЕК-клеток. Помимо ЕК-клеток присутствует на эмбриональных, мышечных, нервных, эпителиальных клетках, некоторых активированных Т-клетках. CD-56 позитивны такие гематологические опухоли, как ЕК-клеточная или Т-клеточная лимфома, анапластическая крупноклеточная лимфома, плазмоклеточная миелома (плазмоклеточная лейкемия CD-56 негативна). Это молекулы адгезии клеточной поверхности, которые облегчают гемофильную адгезию и участвуют в контактном ингибировании роста, ЕК-клеточной цитотоксичности, развитии нервных клеток.
CD-138
Это маркёр плазматических клеток. Его определение показано при неполной морфологической картине хронического эндометрита.
LIF
LIF — лейкемия-ингибирующий фактор — продуцируется различными типами клеток, в том числе Т-клетками, клетками миеломоноцитарной линии, фибробластами, клетками печени, сердца и меланомы. LIF в течение длительного времени поддерживает эмбриональные стволовые клетки в недифференцированном состоянии, подавляя спонтанную дифференцировку. Кроме того, LIF обладает свойствами стимулировать синтез белков острой фазы в гепатоцитах, стимулировать дифференцировку холинергических нервов и подавлять адипогенез ингибируя липопретеинлипазу в адипоцитах. В эндометрии здоровых женщин экспрессия LIF резко возрастает в середине секреторной фазы, совпадая с предполагаемым окном имплантации.
Эндометрий бесплодных женщин и женщин с необъяснимым рецидивирующим выкидышем синтезирует значительно меньше LIF и его рецепторов (LIFR и gp130) в период рецептивности по сравнению со здоровыми женщинами. Обнаружена связь мутаций гена LIF и наличия антифосфолипидных антител у бесплодных женщин: у 100% женщин с мутациями гена LIF детектировались антифосфолипидные антитела, тогда как у бесплодных женщин, без этого вида мутаций, частота выявления антифосфолипидных антител составила 30% (p = 0,0035). LIF-R необходим для нормального развития мотонейронов в головном и спинном мозге. При нарушениях гена LIF-R, в эксперименте отмечают дефекты развития плаценты, скелета, нервной системы у эмбрионов, приводящие к перинатальной смерти. Возможные области использования этого маркёра — в изучении таких видов патологии, как онкологические, аутоиммунные и воспалительные заболевания в качестве диагностического инструмента, а также для мониторинга и терапевтического вмешательства.
Диагностическое выскабливание слизистой оболочки матки рекомендовано проводить в среднюю и позднюю фазу пролиферации — на 7–10-й день менструального цикла.
Интерпретация результатов
Единицы измерения: проценты (%).
Интерпретация: описательный ответ с указанием процента клеток, в которых определяется ЭР и ПР, CD56, LIF. Даётся подсчет пиноподий.
Референсные значения: диапазон значений индивидуален, зависит от фазы менструального цикла, анамнеза, проведённого лечения и клинического диагноза.
Форма выдачи результата
Проводится морфологическая оценка состояния эндометрия или морфологическая оценка опухоли молочной железы согласно классификации ВОЗ (2012).
Проводится подсчёт количества окрашенных ядер клеток желёз эндометрия, учитывается процентное соотношение окрашенных/неокрашенных ядер клеток на 100 учтённых клеток в 10 репрезентативных полях зрения при 40-кратном увеличении.
Экспрессия er pr в стромальном компоненте снижена что это значит
Исследование проводится в целях диагностики патологии репродуктивной функции, а также для оценки тяжести гиперпластического процесса. Определение уровня рецепторов эстрогена и рецепторов прогестерона в среднюю стадию фазы секреции позволяет оценить степень эндометриальной дисфункции. Ki-67 – индекс пролиферативной активности – белок, который синтезируется в ядрах клеток, находящихся в процессе деления. Является одним из специфических маркеров хронического эндометрита. Исследование экспрессии Ki-67 маркера позволяет подтвердить наличие диспластических процессов, выявить поражения шейки матки с высоким риском дальнейшей прогрессии.
Метод исследования
Жидкостная цитология + иммуноцитохимическое исследование.
Какой биоматериал можно использовать для исследования?
Аспират из полости матки.
Общая информация об исследовании
Стандартное морфологическое исследование эндометрия включает определение клеточного состава, соотношения клеток, фазы менструального цикла, патологических изменений – признаков атипии, инфильтрации воспалительными клетками при световой микроскопии. Материалом для исследования является эндометрий, полученный методом аспирационной биопсии эндометрия или при гистероскопии с биопсией эндометрия, после выскабливания (кюретаж полости матки).
Иммуноцитохимия – это метод исследования клеток, основанный на обнаружении специфических антигенов с помощью присоединения к ним антител, меченных флюорохромом или ферментом. Антигены – молекулы белков или углеводов, имеющие уникальную трёхмерную структуру, способные индуцировать образование антител. Антитела – иммуноглобулины, распознающие антигены и присоединяющиеся к ним во время реакции «антиген-антитело». Антигены и антитела неразличимы при исследовании методом световой и электронной микроскопии. Для обнаружения специфических антигенов к образцу клеток добавляют реагент, содержащий меченные флюорохромом или ферментом антитела, в результате чего образуется иммунный комплекс «антиген-антитело». Комплексы формируют специфическое окрашивание клеток и их внутренних структур, обеспечивая детекцию патологических изменений на молекулярном уровне. Иммуноцитохимическое исследование позволяет верифицировать онкологические заболевания, метастатические поражения, определить их гистологическую принадлежность, оценить экспрессию маркеров, влияющих на прогноз заболевания и подбор схемы эффективной химиотерапии.
Иммуноцитохимическое исследование образца, содержащего клетки эндометрия, позволяет определить выраженность экспрессии рецепторов к эстрогену и прогестерону и определить их соотношение. В нормальном эндометрии происходит циклическое изменение баланса рецепторов женских половых гормонов в зависимости от фазы менструального цикла.
В стадию ранней пролиферации после пятого дня цикла начинается прогрессивное увеличение рецепторов к эстрогену (ER) в строме и эпителии желёз, продолжающееся в позднюю пролиферативную фазу с максимальным пиком экспрессии в предовуляторном периоде и во время овуляции. После овуляции отмечается постепенное снижение уровня рецепторов к эстрогену, обусловленное действием прогестерона.
Увеличение рецепторов к прогестерону начинается в позднюю пролифертивную фазу, достигая максимальной экспрессии в предовуляторном период, во время овуляции. В секреторную фазу железистый эпителий постепенно уменьшает экспрессию рецепторов к прогестерону, в то время как экспрессия рецепторов на стромальных клетках продолжает увеличиваться.
Максимальное количество клеток эндометрия, экспрессирующих рецепторы к женским половым гормонам, отмечается в конце поздней пролиферативной фазы и предовуляторный период, со смещением соотношения в сторону рецепторов к эстрогену (референтный интервал ER/PR составляет от 2-4:1). В секреторную фазу соотношение ER/PR смещается в сторону рецепторов к прогестерону и составляет 1:2, в стромальных клетках до 1:3 к концу менструального цикла.
К концу менструального цикла количество рецепторов к женским половым гормонам снижается до минимальных значений.
Одной из причин бесплодия может быть повышение экспрессии эстрогеновых рецепторов с одновременным снижением экспрессии прогестиновых рецепторов в клетках эндометрия в раннюю секреторную фазу, что нарушает способность эндометрия к имплантации оплодотворенной яйцеклетки.
При хроническом эндометрите отмечается смещение максимального пика экспрессии рецепторов эстрогена и прогестерона в сторону пролиферативной фазы, уменьшение количества клеток, экспрессирующих рецепторы, более раннее истощение рецепторного аппарата с резким снижением эстрогеновых рецепторов в раннюю секреторную фазу. Аналогичные изменения характерны и для рецепторов к прогестерону в клетках эпителия желез.
Для неопластической трансформации эндометрия характерно снижение рецепторов к эстрогену и прогестерону. До 80% опухолей эндометрия экспрессируют рецепторы к эстрогену. Высокая экспрессия рецепторов женских половых гормонов с сохранением соотношения ER/PR свидетельствует о высокой дифференцировке клеток опухоли, что связано с более благоприятным прогнозом в отношении выживаемости. Низкое содержание рецепторов прогестерона позволяет прогнозировать лучший ответ на химиотерапию гормональными препаратами (прогестинами).
Определение экспрессии Ki-67 проводится методом иммуноцитохимии. К образцу, содержащему клетки эндометрия, добавляют меченый антиген к белку Ki-67. В результате реакции «антиген-антитело» формируется специфическое окрашивание ядер клеток. Для анализа выполняется подсчет позитивно меченных клеток, оценка интенсивности окрашивания ядра.
Экспрессия Ki-67 значительно повышается при атипической гиперплазии, раке эндометрия.
При всех типах гиперплазии эндометрия отмечается снижение экспрессии ER, PR и Ki-67 по сравнению с нормальным эндометрием в фазу пролиферации. При сравнении результата иммуноцитохимии с нормальным эндометрием в секреторную фазу наблюдается обратная картина: экспрессия ER, PR и Ki-67 значительно выше при гиперплазии эндометрия.
При раке эндометрия экспрессия ER и PR снижается с одновременным увеличением Ki-67. Чем выше экспрессия Ki-67, тем более низкая дифференцировка клеток опухоли, что свидетельствует о менее благоприятном прогнозе для жизни.
Когда назначается исследование?
Что означают результаты?
Соотношение рецепторов эстрогена к рецепторам прогестерона (ЕR/PR) в строме составляет 4:1.
При хроническом эндометрите отмечается смещение пика уровня экспрессии рецепторов эстрогенов и прогестерона в сторону средней и поздней стадий фазы пролиферации, в то время как в нормальном эндометрии пик экспрессии приходится на овуляцию.
Нарушение экспрессии рецепторов половых гормонов связано с формированием гиперплазии эндометрия и определяет форму и тяжесть гиперпластического процесса.
При простой железистой гиперплазии без атипии наблюдается повышение рецепторов ER и PR в эпителии желез и стромальных элементах с одновременно высокими показателями экспрессии маркера пролиферации Ki-67.
При неопластической трансформации клетки эндометрия частично или полностью утрачивают рецепторы к эстрогенам и прогестерону. Соотношение рецепторов ER/PR в клетках различных аденокарцином различается и связано со степенью морфологической дифференцировки опухоли.
Степень экспрессии белка Ki-67 увеличивается по мере нарастания неопластических изменений эпителия шейки матки и достигает максимума при цервикальной плоскоклеточной карциноме. Его величина прямо коррелирует со степенью гистологической злокачественности.
Степень экспрессии Ki-67 выражается в процентах.
69 Диагностика хронического эндометрита: CD20+, CD56+, CD138+, HLA-DR
29 Гистологическое исследование биопсийного материала
38 Антиген плоскоклеточной карциномы (SCCA)
Кто назначает исследование?
Гинеколог, эмбриолог, онколог, эндокринолог, цитолог.
1) Techniques of immunohistochemistry: principles, pitfalls, and standardization. Richard W. Cartun, Clive R. Taylor and David J. Dabbs. Diagnostic Immunohistochemistry, Chapter 1, 1-46.
2) Benign Endometrium. David W Kindelberger and Marisa R Nucci. Gynecologic Pathology: A Volume in the Series: Foundations in Diagnostic Pathology, Chapter 6, 197-232.
3) The Female Genital Tract. Lora Hedrick Ellenson and Edyta C. PirogRobbins and Cotran Pathologic Basis of Disease, Chapter 22, 991-1042.
Новые подходы к оценке эндометриальной дисфункции
Полный текст
Аннотация
Введение. Применение современных методов оценки морфофункционального состояния эндометрия для верификации и изучения экспрессии половых стероидных гормонов, провоспалительных маркеров и маркеров ангиогенеза с использованием конфокальной лазерной сканирующей микроскопии позволит объективно изучить исследуемые маркеры в патогенезе эндометриальной дисфункции.
Цель исследования заключалась в оценке экспрессии рецепторов ER и PR в гистогенетических структурах эндометрия у пациенток с эндометриальной дисфункцией.
Материал и методы. Для проведения иммунофлюоресцентной конфокальной лазерной сканирующей микроскопии применяли биоптаты эндометрия, полученные с помощью пайпель-биопсии или соскоба из полости матки. Для иммуногистохимического анализа допустимо использование как криостатного материала, так и парафиновых блоков. В качестве первичных антител использовали моноклональные антитела к ER (1 : 60, Dako, Дания) и PR (1 : 50, Dako, Дания), в качестве вторичных — антитела, конъюгированные с флуорохромом Alexa Fluor 647 (1 : 1000, Abcam, Англия). Для окрашивания ядер клеток применяли Hoechst 33258 (Sigma, США).
Результаты. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия позволяет провести качественную и количественную оценку исследуемых маркеров в разных структурах эндометрия.
Ключевые слова
Полный текст
Показатель рождаемости является главным интегральным критерием социально-экономического благополучия государства. Несмотря на положительную динамику демографических показателей в Российской Федерации, проблема бесплодия остается одной из главных аспектов современной гинекологий. В последнее десятилетие наметилась тенденция к поздней реализации репродуктивной функции у женщин, которая становится главным вызовом современному обществу, поскольку доказано, что у женщин с возрастом отмечается высокая встречаемость как соматической, так и гинекологической патологии. Следует отметить, что бесплодие является коморбидным состоянием, когда совокупность нескольких факторов формирует показания для применения методов вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ).
Общеизвестно, что лидирующее место в структуре гинекологических заболеваний занимают воспалительные заболевания органов малого таза (ВЗОМТ), миома матки и эндометриоз, приводя к опосредованному и/или непосредственному влиянию заболевания на репродуктивную функцию женщины.
Эндометрий является «зеркалом», отражающим патологические процессы в органах малого таза, и частота встречаемости нарушения морфофункционального состояния эндометрия при бесплодии, ассоциированном с ВЗОМТ, наружным генитальным эндометриозом (НГЭ) и миомой матки, довольно высока. Кроме этого в диагностике эндометриальной дисфункции решающее значение приобретают методы оценки патологических изменений. Внедрение иммуногистохимического метода исследования в гинекологическую практику позволило расширить понимание патогенеза заболеваний многих репродуктивных органов.
Результаты наших многолетних исследований показали, что у пациенток с бесплодием, ассоциированным с ВЗОМТ, у пациенток с НГЭ и пациенток с миомой матки имеет место общность морфологических проявлений патологии эндометрия, в том числе нарушение секреторной трансформации, связанное с хроническим воспалительным процессом в эндометрии [1, 2].
Внедрение конфокальной лазерной сканирующей микроскопии в клиническую практику, наряду с общепринятыми методиками, позволит оценить значение половых стероидных гормонов, провоспалительных маркеров, маркеров молекул клеточной адгезии и других биологически активных веществ в патогенезе эндометриальной дисфункции.
Материал и методы исследования
Биоптаты эндометрия были получены от пациенток с бесплодием, ассоциированным с ВЗОМТ, от пациенток с бесплодием, ассоциированным с НГЭ, и пациенток с неэффективными циклами экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). Образцы эндометрия обезвоживали в 10 % нейтральном забуференном растворе формалина (рН 7.2), проводка материала осуществлялась с помощью станции автоматической проводки материала и станции заливки Leica (Германия). Изготовленные на микротоме парафиновые срезы толщиной 4–6 мкм помещали на предметные стекла, покрытые пленкой из поли-L-лизина (Sigma, Япония). Инкубацию с первичными антителами к ER (1 : 60, Dako, Дания) производили во влажной камере в течение 30 минут при комнатной температуре, к PR (1 : 50, Dako, Дания) — в течение часа при температуре 37 °C. Далее срезы инкубировали с вторичными антителами, конъюгированными с флуорохромом Alexa Fluor 647 (1 : 1000, Abcam, Англия), при комнатной температуре в течение получаса в темноте. Ядра клеток докрашивали Hoechst 33258 (Sigma, США) в течение 1 минуты. Готовые препараты заключали под покровные стекла в монтирующую среду Dako Fluorescent Mounting Medium (Dako, США). Трехмерную визуализацию срезов образцов осуществляли с помощью конфокального микроскопа FlueView 1000 (Olympus, Япония) при увеличении ×100, ×200, ×400. Для верификации экспрессии исследуемых маркеров использовали лазеры с длиной волны 650, 500 и 405 нм. Срезы толщиной 120 мкм сканировали послойно с шагом 1,5–2 мкм. Реконструкция трехмерного изображения ткани проводилась в программе Imaris (Bitplane, Switzerland).
Результаты исследования и их обсуждение
В последние годы конфокальная лазерная сканирующая микроскопия активно внедряется в клиническую практику в таких областях медицины, как дерматология, гастроэнтерология, офтальмология, гинекология и др. Метод конфокальной микроскопии был разработан для преодоления одного из недостатков обычного светового микроскопа — наличия внефокусных лучей, которые снижают контраст изображения.
Первый патент на конфокальный микроскоп был получен М. Мински в 1957 г. В течение длительного времени конфокальные микроскопы существовали в виде экспериментальных образцов, и только в середине 80-х начался серийный выпуск этих приборов такими фирмами, как BioRad, Zeiss, Leica, Nikon, Olympus. В современных приборах в качестве источников света широко используются лазеры, обладающие высокой интенсивностью и монохроматичностью излучения. Поэтому сейчас такие приборы называют конфокальными лазерными сканирующими микроскопами (КЛСМ). Для управления системой формирования и хранения изображений, а также обработки результатов применяются компьютеры. Основные характеристики КЛСМ подробно описаны в статьях и руководствах по конфокальной лазерной сканирующей микроскопии [3–5].
КЛСМ позволяет получить изображение с объекта толщиной от 1,3 мкм. Благодаря возможности сканирования серии оптических срезов можно провести объемную реконструкцию объекта и получить его трехмерное изображение, не используя трудоемкую методику изготовления и фотографирования серийных гистологических срезов.
Современные конфокальные микроскопы могут работать в мультиспектральном режиме, при котором можно получать изображение одного и того же объекта, окрашенного несколькими красителями в разных спектральных областях. Типичным и наиболее распространенным применением мультиспектрального режима работы КЛСМ является исследование в клетке или ткани колокализации двух и более веществ, например белков.
В наших исследованиях мы изучали локализацию рецепторов эстрогена и прогестерона с помощью непрямого иммуногистохимического метода, визуализация проводилась с использованием вторичных антител, конъюгированных с флуорохромом. Такое исследование позволяет понять, существует ли причинно-следственная связь между выявляемыми белками. Кроме того, в случае существенной толщины среза при анализе с помощью обычного светового микроскопа трудно корректно определить локализацию выявляемых белков в объеме.
Исследования, проведенные в НИИ АГиР им. Д.О. Отта, показали высокую диагностическую значимость данного метода при изучении репаративных процессов в зоне послеоперационного рубца после кесарева сечения, при оценке экспрессии фактора роста нервов в очагах эндометриоидных гетеротопий, а также при изучении эндометриальной дисфункции у пациенток с бесплодием [2, 6, 7].
В статье представлены основные результаты осуществленных нами исследований эндометриальной дисфункции у пациенток с нарушением репродуктивной функции, ассоциированной с ВЗОМТ, у пациенток с бесплодием, ассоциированным с НГЭ, и пациенток с неэффективными циклами ЭКО.
Одним из ключевых механизмов эндометриальной дисфункции является нарушение экспрессии рецепторов эстрогена и прогестерона на фоне хронического воспаления в эндометрии. Однако особая роль в патологии репродуктивной функции принадлежит не самому воспалительному процессу в слизистой оболочке тела матки, а его непосредственному или опосредованному патологическому влиянию на рецепторный статус эндометрия. Именно рецепторный дисбаланс является детерминантой нарушения репродуктивной функции.
Ранее было показано, что наиболее диагностически значимым периодом исследования эндометрия является средняя стадия фазы секреции, поэтому оценка экспрессии рецепторов половых стероидных гормонов при эндометриальной дисфункции была проведена именно в период «окна имплантации». Иммуногистохимическое исследование экспрессии рецепторов эстрогена и прогестерона в зависимости от фазы цикла эндометрия подробно представлено в книге «Молекулярная морфология», в главе, посвященной молекулярным аспектам эндометриальной дисфункции [8].
Нами было показано, что у здоровых пациенток, имеющих нормальный овариальный цикл, с началом средней стадии фазы секреции экспрессия рецепторов ER в железах и строме эндометрия начинает повышаться (до 35–40 %) и носит неравномерный характер распределения. При этом экспрессия рецепторов PR в эпителии желез снижается и может достигать нулевых значений, однако в строме эндометрия экспрессия характеризуется максимальными значениями (100 %) и равномерным распределением рецепторов (рис. 1, а, b).
Рис. 1. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия: a — неравномерное распределение экспрессии ЕR (желтая флуоресценция) в строме эндометрия, в железистом компоненте экспрессия снижена до 0; b — равномерное распределение экспрессии PR (зеленая флуоресценция) в строме эндометрия, в железистом компоненте экспрессия снижена до 0; c — снижение экспрессии рецепторов PR при хроническом эндометрите. Для окраски ядер использовали Hoechst: а — синяя флуоресценция; b, c — красная флуоресценция. ×200
У пациенток с бесплодием, ассоциированным с ВЗОМТ и с НГЭ на фоне высокой частоты встречаемости хронического эндометрита, отмечается нарушение секреторной трансформации эндометрия в период «окна имплантации». Воспалительные изменения в органах малого таза приводят к нарушению морфофункционального состояния эндометрия и рецепторному дисбалансу (рис. 1, с). На фоне локальной воспалительной реакции в эндометрии происходит нарушение соотношения рецепторов ER и PR в строме эндометрия. Следует отметить, что хронический воспалительный процесс способствует гиперпластической трансформации эндометрия (рис. 2).
Рис. 2. Конфокальная лазерная ска нирующая микроскопия: a, b — неравномерное распределение и снижение экспрессии PR (зеленое окрашивание) в эндометрии у пациенток с бесплодием, ассоциированным с НГЭ; c — неравномерное снижение экспрессии PR в зоне фибропластических изменений стромы. 3D-реконструкция. Для окраски ядер использовали Hoechst (красная флуоресценция). ×200
Гиперпластическая трансформация эндометрия под влиянием абсолютной и относительной гиперэстрогенемии у пациенток с нарушением репродуктивной функции служит одним из факторов бесплодия. Нарушение синхронизации эстрогена и прогестерона приводит к дисбалансу половых стероидов, что служит причиной гиперпластических и пролиферативных процессов в эндометрии, наличие которых повышает риск возникновения онкологических трансформаций в репродуктивных органах у женщин разных возрастных групп [9, 10].
При гиперплазии эндометрия экспрессия рецепторов ER и PR в гистогенетических структурах эндометрия характеризуется неравномерным распределением и высокими цифрами экспрессии обоих маркеров 80–100 % (рис. 3). Известно, что эстрадиол усиливает синтез собственных рецепторов, рецепторов прогестерона и рецепторов андрогенов. Андрогены могут усиливать синтез собственных рецепторов. Прогестерон не только не усиливает синтез собственных рецепторов, но и подавляет их, также подавляет и синтез рецепторов эстрадиола [11–15].
Рис. 3. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия. Неравномерное распределение экспрессии PR (зеленая флуоресценция) в строме эндометрия при гиперплазии эндометрия: а — при увеличении ×200, 3D-реконструкция; b, c — при увеличении ×200. Для окраски ядер использовали Hoechst (красная флуоресценция)
Обратной стороной гиперпластической трансформации эндометрия является его гипоплазия (рис. 4). В настоящее время нет единого мнения о причинах гипоплазии эндометрия. В то же время следует отметить, что гипопластический эндометрий или атрофический эндометрий может быть следствием хронического эндометрита, что было подробно описано еще К.П. Улезко-Строгановой в 1926 г. По мнению автора, причинами атрофического эндометрия является расстройство кровоснабжения и рубцующаяся межжелезистая соединительная ткань [16].
Рис. 4. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия: a, b — экспрессия рецепторов ЕR (желтая флуо ресценция), PR (зеленая флуоресценция) в железах и стромальном компоненте эндометрия у пациенток с неэффективными циклами ЭКО (гипопластичный эндометрий); с — экспрессия CD34+ в гипопластичном эндометрии. Для окраски ядер использовали Hoechst: a, c — синяя флуоресценция, b — красная флуоресценция. ×100
Морфологические особенности гипопластического эндометрия выражаются в недостаточном формировании железистого аппарата эндометрия и изменениях в маточном кровотоке, а также снижении экспрессии фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и патологии ангиогенеза, что крайне негативно влияет на рецептивность эндометрия [17].
В исследовании Е.Ю. Волковой (2014) показано, что формирование «тонкого» эндометрия у женщин с нарушением репродуктивной функции ассоциировано с высокой частотой ранее перенесенных хронических воспалительных заболеваний органов малого таза, невынашиванием беременности и внутриматочными вмешательствами. Показано, что иммуноморфологическая картина «тонкого» эндометрия в большинстве случаев характеризуется остаточными явлениями хронического эндометрита и изменением имплантационных свойств эндометрия [18].
Таким образом, разработка и внедрение новых перспективных методов диагностики морфофункционального состояния эндометрия является одним из важных факторов, способствующих более детальному изучению процессов, детерминирующих имплантацию и формирование плаценты на тканевом, клеточном и молекулярном уровнях. Оценка экспрессии рецепторов половых стероидных гормонов у пациенток с бесплодием, ассоциированным с ВЗОМТ, НГЭ, миомой матки и неэффективными циклами ЭКО, а также с гиперпластическими процессами, служит качественной характеристикой процессов трансформации эндометрия.
Своевременная ранняя диагностика патологических изменений в органах малого таза с учетом объективных данных лабораторных методов исследования, включая КЛСМ, позволит провести адекватную этиопатогенетическую терапию, нацеленную на сохранение и восстановление репродуктивной функции.
В заключение стоит отметить, что, несмотря на несомненные преимущества применения конфокальной микроскопии в клинической практике, в проведении подобных исследований существуют определенные сложности, сопряженные с высокой стоимостью оборудования и его эксплуатации, а также невозможностью повторного исследования в связи с нестабильностью флуорохромов.